人乳頭瘤病毒58型的基因變異,病毒載量及整合狀態(tài)與宮頸病變的相關性研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是引起宮頸癌(cervicalcancer,CC)發(fā)生的重要因素。在女性生殖道中約發(fā)現(xiàn)超過40種人乳頭瘤病毒,其中15種為與宮頸癌發(fā)生相關的高危型(HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68,73和82)。HPV16和HPV18是最常見的與宮頸癌相關的型別,而非HPV16/18型在宮頸細胞內(nèi)瘤樣變(cervical intrae

2、pithelial neoplasia,CIN)的分布有著顯著的地域性差異。我們的前期研究顯示HPV58型占中國東北地區(qū)宮頸癌患者第二位,感染率為7.79%。然而,并非所有高危型HPV感染都會最終進展為惡性病變,一般認為長期持續(xù)的HPV感染會導致患者從CIN逐步進展為宮頸癌,同時有研究顯示某些特異的型內(nèi)變異可能會影響HPV的持續(xù)感染而最終導致癌前病變轉變?yōu)榘┌Y。
   HPV的潛在致癌性主要與E6和E7兩個致癌蛋白有關。HPV

3、E6和E7蛋白分別通過使腫瘤抑制因子P53和視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma protein, pRb)功能失活而控制細胞周期和凋亡。L1蛋白是HPV主要的衣殼蛋白,能夠自己裝配成病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)從而誘導高水平的中和抗體產(chǎn)生并在動物感染動物乳頭瘤病毒后的模型中顯示出很高的保護性。由于氨基酸序列的替換可能會影響L1蛋白的結構、功能或抗原特性,所以研究L1區(qū)域的改變將對定義設計

4、疫苗和診斷藥物的相關表位有重要意義。HPV長控制區(qū)(long control region,LCR)包含DNA復制起始,增強元件和轉錄增強序列,是主要的病毒轉錄調控區(qū)。LCR通過與轉錄因子的相互作用,調節(jié)早期區(qū)基因的轉錄。目前,國際上關于HPV基因變異導致宮頸病變的研究主要集中在HPV16和HPV18型,關于HPV58變異情況的研究數(shù)據(jù)很少。
   高危型HPVs持續(xù)感染導致宮頸癌的發(fā)生是一個多因素,多階段,長時間的累積過程,約

5、80%的女性在其一生中會感染HPV,而最終僅一小部分患者會發(fā)展為宮頸癌。因此,除了病毒自身的結構特點外,感染病毒載量及病毒整合情況等可能都對宮頸癌的發(fā)生有影響,病毒載量可能為一個早期檢查或預測高度宮頸病變和宮頸癌的一個標志物。最近的研究數(shù)據(jù)顯示高危型病毒載量與高度鱗狀上皮內(nèi)細胞病變(high grade squamous cell intra-epithelial lesions,HSILs)高度相關。
   HPVDNA在良性

6、腫瘤和低度癌前病變中多以游離形式存在,而在惡性病變及高度癌前病變中常以單拷貝或多拷貝整合于宿主細胞基因組中。病毒基因整合入宿主細胞的部位通常發(fā)生在E1或E2區(qū)。病毒整合時,E2的斷裂或缺失導致其開放閱讀架失活,對病毒癌基因表達負反饋調節(jié)作用缺失,使E6、E7基因過度表達而導致細胞生長失控。因此可以通過E2/E6比來了解HPV與宿主細胞的整合狀態(tài),評價宮頸病變的惡性程度。目前,有關HPV整合的研究大多數(shù)針對HPV16和18型,研究顯示HP

7、V在不同宮頸病變中的整合率隨HPV感染型別的不同而變化。
   由于HPV58在中國乃至亞洲婦女中有著相當高的流行率及致癌性,本課題分析了HPV58型的E6、E7、L1基因及LCR的的基因變異情況與宮頸病變的相關性。通過對感染的HPV58型病毒載量的測定及其與宿主細胞的整合狀態(tài)的分析,分析其與宮頸病變的相關性,探討HPV58型在宮頸病變發(fā)生中的致病機制。
   實驗方法
   1、采用HybriMax法對2938

8、例宮頸拭子標本進行HPV基因分型檢測,篩選出235例標本為單一HPV58型感染,按其對應的病理組織學診斷分組:正常細胞47例,慢性或急性宮頸炎癥127例,ASCUS19例,CIN-1為15例人,CIN-2和CIN-3為23例,宮頸癌4例。采用半巢式聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)分別擴增E6、E7、L1基因及LCR調控區(qū),然后對其擴增產(chǎn)物進行純化測序,并與HPV58型標準株比較,分析不同宮頸病變

9、患者的HPV58型各基因變異情況。
   2、于中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科進行宮頸癌機會篩查的女性中選出102例單一HPV58型感染的陽性標本,同時按其宮頸脫落細胞或宮頸組織進行細胞學及組織學評價,分為正常及宮頸炎組34例、LSILs組31例,及HSILs組28例,CC組9例。通過實時熒光定量PCR測定,以E6的含量作為HPV58型的病毒載量,以E2與E6基因的含量計算E2/E6比值,并根據(jù)cut-off值判斷HPV58的整

10、合狀態(tài)。
   結果
   1、單一HPV58型陽性的235個樣本的基因變異存在多態(tài)性。HPV58型的E6(83.8%),E7(76.7%),L1(90.8%)基因及LCR(91.4%)都有很高的基因變異率。其中最常見的變異分別為E6基因的C307T(52.4%),E7基因的T744G(74.9%),L1基因的A6014C(56.9%)和LCR的C7266T(53.4%)變異。共有9個核苷酸變異發(fā)生于E6基因,其中A14

11、0G(T11A),A184C(E25D),G266C(V53L)和A313G都是新發(fā)現(xiàn)的變異。E7基因序列呈現(xiàn)4種典型的核苷酸改變,分別為G761A(G63D),G694A(G41R), T803C(V77A)和T744G。在L1基因中,共發(fā)現(xiàn)39個變異發(fā)生在34處核苷酸位點,有13個氨基酸發(fā)生了替換,大部分變異(21/39)以前都未曾報道。LCR中,共發(fā)現(xiàn)了29處變異,包括28處堿基替換和一處插入TGTCAGTTTCCT共12bp的變

12、異,其中有8處為新發(fā)現(xiàn)的變異。最常見的發(fā)生在A7714C位的變異位于轉錄因子C/EBP結合位點上,且A7714C的變異顯示其更易出現(xiàn)在宮頸上皮內(nèi)瘤變的病例中(P=0.037)。我國東北地區(qū)婦女感染HPV58型的主要流行株屬于A系,本研究中共有142株HPV58型病毒屬于此系(142/174,81.6%)。
   2、本研究中共收集102例HPV基因分型檢測HPV58型感染樣本。所有樣本的HPV58病毒載量經(jīng)過內(nèi)參β-actin標

13、準化后的數(shù)值(copies/基因組當量)進行比較,各組中位數(shù)分別為:正常及宮頸炎組412.99,LSILs組821.04,HSILs組1039.55及CC組657.04,除CC組外,其余各組病毒載量隨宮頸病變的嚴重程度而增加,但各組間的病毒載量并無統(tǒng)計學差異。根據(jù)E2/E6的比值判斷,本研究檢測到的102株HPV58型病毒在體內(nèi)感染狀態(tài)以部分整合型為主,80株(78.4%)為部分整合型,20株(19.6%)為游離型,2株(2.0%)完全

14、整合型。其中CC組與其它三組比較,E2/E6比值顯著降低,P=0.001。
   結論:
   1、HPV58型A系是中國東北婦女中最主要的HPV58型流行株。研究中發(fā)現(xiàn)HPV58型基因具有很高的變異率,特別是位于E6,L1基因及LCR調控區(qū)的新核苷酸變異。同時,本研究發(fā)現(xiàn)在LCR調控區(qū)的A7714C變異與HPV58型感染婦女的宮頸病變程度相關,對于認識HPV58型的致病機制及本地區(qū)的預防和治療具有重要意義。
  

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