水稻中與水稻-稻瘟病菌互作相關(guān)的microRNA初步研究.pdf

1、稻瘟病是水稻最重要的病害之一，嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量，因此研究水稻與稻瘟病菌相互作用具有重要意義。在植物中，miRNA可以調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、生物和非生物脅迫等各個(gè)過(guò)程，但關(guān)于miRNA調(diào)節(jié)水稻與稻瘟病菌相互作用的研究還未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究的主要目的是鑒定參與水稻-稻瘟病菌互作過(guò)程中水稻的miRNA。
　　在本研究中，我們對(duì)感病材料麗江新團(tuán)黑谷(LTH)和抗病材料IRBLkm-Ts、IRBLz5-CA接種稻瘟病菌后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PC

2、R實(shí)驗(yàn)，DAB染色和臺(tái)盼藍(lán)染色等方法比較了防御反應(yīng)的強(qiáng)弱;隨后，對(duì)刪和IRBLkm-Ts接種稻瘟病菌混合菌分生孢子，在接種前、接種后12小時(shí)和24小時(shí)分別取樣，提取小RNA，構(gòu)建了6個(gè)小RNA文庫(kù)并對(duì)這6個(gè)小RNA文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序分析;用轉(zhuǎn)基因的方法獲得了過(guò)表達(dá)miR160a和miR398b的轉(zhuǎn)基因水稻植株，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和接菌實(shí)驗(yàn)，鑒定過(guò)表達(dá)miR160a和miR398b對(duì)稻瘟病抗性的影響。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，我們得到了如下結(jié)果:

3、
　　首先，我們發(fā)現(xiàn)IRBLkm-Ts比IRBLz5-CA具有更強(qiáng)烈的防御反應(yīng)。主要表現(xiàn)為IRBLkm-Ts比IRBLz5-CA有更少的病斑;4個(gè)防衛(wèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄在IRBLkm-Ts中明顯高于IRBLz5-CA;在IRBLkm-Ts中過(guò)氧化氫積累量高于IRBLz5-CA。這些結(jié)果說(shuō)明利用IRBLkm-Ts可能更容易獲得與水稻抗稻瘟病相關(guān)的miRNA。
　　其次，我們篩選出33個(gè)在抗、感材料間和稻瘟病菌侵染前后積累量具有顯著

4、差異的miRNA。我們將這33個(gè)miRNA分為三類(lèi):(1)在LTH中沒(méi)有明顯變化或降低而在IRBLkm-Ts中明顯增加或沒(méi)有明顯變化;(2)在LTH中變化不明顯或增加而在IRBLkm-Ts中明顯降低或沒(méi)有明顯變化;(3)在LTH和IRBLkm-Ts中都增加。我們推測(cè)第1類(lèi)miRNA正向調(diào)節(jié)水稻抗性，第2類(lèi)miRNA負(fù)向調(diào)節(jié)水稻抗性，第3類(lèi)miRNA則可能參與調(diào)節(jié)基礎(chǔ)抗性。
　　再次，過(guò)量表達(dá)miR160a和miR398b可提高稻瘟

5、病抗性。MiR160a在感病材料中接菌前和接菌后累積無(wú)明顯變化，而在抗病材料中接菌后增加了10倍以上，預(yù)示miR160a正向調(diào)節(jié)水稻抗性。MiR398b在感病和抗病材料中均在接種后累積顯著增加，預(yù)示miR398b可能參與對(duì)水稻稻瘟病基礎(chǔ)抗性的調(diào)控。同時(shí)，miR160a和miR398b的靶基因表達(dá)與相應(yīng)miRNA累積量呈負(fù)相關(guān)性，表明miR160a和miR398b是通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)參與調(diào)控稻瘟病抗性。過(guò)表達(dá)miR160a和miR

6、398b的轉(zhuǎn)基因水稻接種稻瘟病菌后，與對(duì)照相比病斑明顯變小，菌絲相對(duì)生長(zhǎng)量降低，分生孢子數(shù)量明顯減少，說(shuō)明miR160a和miR398b可以明顯增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病的抗性。
　　最后，miR160a和miR398b以不同方式調(diào)控對(duì)稻瘟病菌的防御。我們發(fā)現(xiàn)miR160a過(guò)表達(dá)材料中早期防衛(wèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，而晚期抗性標(biāo)記基因轉(zhuǎn)錄則顯著增強(qiáng);miR398b過(guò)表達(dá)材料中早期和后期抗性標(biāo)記基因轉(zhuǎn)錄都顯著增強(qiáng)。這些結(jié)果提示mi