mTOR依賴性自噬在不同模型中對(duì)心功能不全的雙向調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：
　　本文通過(guò)兩部分研究(1)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)野生型和心臟特異性ADH過(guò)表達(dá)小鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能的影響，以及mTOR依賴性自噬在此過(guò)程中的作用及機(jī)制;(2)衰老對(duì)野生型和MIF敲基因小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響，以及mTOR依賴性自噬在此過(guò)程中的作用及機(jī)制，探討外界刺激或病理狀態(tài)（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、衰老）對(duì)心臟結(jié)構(gòu)與功能的影響，以及ADH與MIF蛋白在此過(guò)程中的作用及內(nèi)在機(jī)制。機(jī)制研究著重探討mTOR依賴性自噬是否發(fā)揮作用及相關(guān)的上游調(diào)節(jié)機(jī)

2、制。
　　方法：
　　第一部分 乙醇脫氫酶通過(guò)減輕氧化應(yīng)激及自噬保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的心臟收縮功能紊亂—PTEN-Akt-mTOR通路的作用
　　1.動(dòng)物模型
　　野生型(FVB)小鼠和ADH心臟特異性過(guò)表達(dá)小鼠分別被注射衣霉素（1mg/kg，1次）或相同體積PBS，48小時(shí)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　2.心臟功能與心肌收縮功能及鈣離子處理能力的檢測(cè)
　　通過(guò)多普勒超聲研究心臟功能;通過(guò)Langendorff系統(tǒng)

3、及Librase酶離體分離小鼠心肌細(xì)胞，在SoftEdge Myocam軟件中記錄心肌細(xì)胞的收縮功能，并應(yīng)用fura-2/AM熒光在雙向激發(fā)熒光相位倍增系統(tǒng)中記錄心肌細(xì)胞鈣離子攝取情況。
　　3.氧化應(yīng)激水平的檢測(cè)
　　應(yīng)用H2DCFDA和DHE染色法分析從小鼠心臟分離的心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。
　　4.蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)
　　應(yīng)用Western Blot分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬以及PTEN-Akt-mTOR通路相關(guān)

4、蛋白的表達(dá)水平。
　　5.體外實(shí)驗(yàn)
　　對(duì)分離的FVB或ADH小鼠心肌細(xì)胞，應(yīng)用衣霉素或（和）自噬抑制劑3-MA、Akt抑制劑AKTI及mTOR抑制劑rapamycin處理，在SoftEdge Myocam軟件中記錄心肌細(xì)胞的收縮功能。
　　第二部分 巨噬細(xì)胞遷移抑制因子缺陷改善衰老導(dǎo)致的心臟炎癥，但惡化衰老導(dǎo)致的心臟重構(gòu)和功能紊亂—自噬的作用
　　1.實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?br>　　(1)衰老動(dòng)物模型。野生型(C57BL/

5、6)小鼠和MIF敲除小鼠分別被正常喂養(yǎng)至3-4個(gè)月，為年輕組;正常喂養(yǎng)至24個(gè)月為衰老組。(2)注射自噬激動(dòng)劑Rapamycin的動(dòng)物模型。腹腔注射Rapamycin（2mg/kg/d，8周）。(3)早衰模型及MIF低表達(dá)模型。應(yīng)用Doxorubicin（0.1μM，24小時(shí)）處理H9C2細(xì)胞建立早衰模型;用MIF siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞建立MIF低表達(dá)模型。
　　2.心臟功能與心肌收縮功能及鈣離子處理能力的檢測(cè)
　　通過(guò)多普勒

6、超聲研究心臟功能;通過(guò)Langendorff系統(tǒng)及Librase酶離體分離小鼠心肌細(xì)胞，在SoftEdge Myocam軟件中記錄心肌細(xì)胞的收縮功能，并應(yīng)用fura-2/AM熒光在雙向激發(fā)熒光相位倍增系統(tǒng)中記錄心肌細(xì)胞鈣離子攝取情況。
　　3.心肌組織結(jié)構(gòu)與心臟纖維化的檢測(cè)
　　Lectin免疫染色研究心臟組織結(jié)構(gòu); Masson Trichorme染色研究心肌纖維化。
　　4.小鼠糖代謝與心肌ATP水平的檢測(cè)

7、　　IPGTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定葡萄糖代謝，分析小鼠的葡萄糖利用能力。應(yīng)用氯仿-甲醇法用分光光度計(jì)（激發(fā)光波長(zhǎng)350nm，發(fā)射光波長(zhǎng)485nm）測(cè)心臟組織勻漿的ATP水平。
　　5.蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)
　　應(yīng)用Western Blot分析衰老、自噬、AMPK-mTOR通路及炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　第一部分 乙醇脫氫酶通過(guò)減輕氧化應(yīng)激及自噬保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的心臟收縮功能紊亂—PTEN-Akt-mTOR通路

8、的作用
　　1.ADH緩解了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的心臟功能下降。在衣霉素作用下，野生型小鼠的心臟功能明顯下降，而ADH過(guò)表達(dá)小鼠的心臟功能明顯優(yōu)于野生型小鼠。給予衣霉素注射后，野生型小鼠心肌攝取鈣離子的能力明顯下降，而ADH過(guò)表達(dá)小鼠鈣離子處理能力得到改善。
　　2.ADH降低了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。
　　3.ADH緩解了衣霉素導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬水平的升高，改善了PTEN-Akt-mTOR通路蛋白表達(dá)的下降。衣霉素的

9、應(yīng)用導(dǎo)致野生型小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白BIP和GADD153及自噬相關(guān)蛋白LC3BⅡ、Atg5、Atg7、P62的表達(dá)上升，而ADH過(guò)表達(dá)小鼠中，這些蛋白的上升程度均明顯低于野生型小鼠。衣霉素的應(yīng)用在野生型小鼠中同樣導(dǎo)致了PTEN、Akt、mTOR磷酸化水平的下降，而在ADH過(guò)表達(dá)小鼠中，這些分子通路蛋白的下降同樣得到了改善。
　　4.ADH通過(guò)Akt-mTOR通路抑制自噬，保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的心肌功能紊亂。在體外研究中，衣霉素的應(yīng)

10、用使離體心肌細(xì)胞收縮功能明顯下降，而在ADH過(guò)表心肌細(xì)胞中，或給予自噬抑制劑3-MA后，衣霉素導(dǎo)致的細(xì)胞收縮功能減低明顯得到緩解。但在ADH過(guò)表達(dá)心肌中加入Akt抑制劑AktI或mTOR抑制劑Rapamycin，ADH的抗衣霉素作用不復(fù)存在。
　　第二部分 巨噬細(xì)胞遷移抑制因子缺陷改善衰老導(dǎo)致的心臟炎癥，但惡化衰老導(dǎo)致的心臟重構(gòu)和功能紊亂—自噬的作用
　　1.MIF缺陷惡化了衰老導(dǎo)致的糖利用功能減低及心臟功能下降。IPGTT

11、實(shí)驗(yàn)中，在給小鼠注射葡萄糖后的15分鐘和60分鐘時(shí)間點(diǎn)，衰老小鼠的血糖水平明顯低于年輕小鼠，而衰老的MIF敲除小鼠降低更為明顯。衰老小鼠的心臟功能與心肌收縮功能明顯減低，而在MIF敲除小鼠中心臟功能進(jìn)一步降低。
　　2.MIF缺陷進(jìn)一步惡化了衰老導(dǎo)致的心肌肥大與纖維化。
　　3.衰老心肌AMPK-mTOR通路受抑制，自噬水平下降，這在MIF缺陷的衰老小鼠中更加明顯。衰老心肌的自噬標(biāo)志蛋白LC2BⅡ表達(dá)下降，P62上升，表明自

12、噬水平下降，廢物堆積增加;AMPK磷酸化水平的下降和mTOR磷酸化水平的增高表明AMPK-mTOR通路收到抑制。MIF缺陷進(jìn)一步加重了這些變化。
　　4.Doxorubicin導(dǎo)致H9C2細(xì)胞早衰標(biāo)志物SA-β-Gal的表達(dá)增加，應(yīng)用MIFsiRNA加重了早衰水平，恢復(fù)MIF表達(dá)后早衰水平得到緩解。
　　5.自噬激動(dòng)劑Rapamycin緩解了MIF缺陷對(duì)衰老心臟功能的惡化。
　　6.MIF缺陷緩解了衰老導(dǎo)致的炎癥水平升

13、高，但通過(guò)Rapamycin激動(dòng)自噬對(duì)炎癥并無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論：
　　我們的研究首次表明ADH自身對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致心功能損傷的保護(hù)作用，并進(jìn)一步說(shuō)明其機(jī)制是通過(guò)緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的氧化應(yīng)激水平，以及降低PTEN-Akt-mTOR通路介導(dǎo)的自噬水平起到心肌保護(hù)作用。我們的研究同樣首次表明了MIF缺陷進(jìn)一步惡化衰老導(dǎo)致的心臟功能下降。衰老導(dǎo)致自噬水平的降低，從而使心臟能量代謝及廢物更新受阻，心臟功能下降。MIF介導(dǎo)的AMPK

14、-mTOR通路可恢復(fù)自噬水平。因此MIF的缺失導(dǎo)致自噬水平進(jìn)一步降低，心臟功能也進(jìn)一步惡化。
　　在這兩個(gè)研究中，mTOR依賴性自噬起到了相反的作用。在ADH-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致了mTOR依賴性自噬的過(guò)度激活，從而細(xì)胞死亡增加，心臟功能受損;而在MIF-衰老模型中，衰老導(dǎo)致mTOR依賴性自噬的下降，使心肌代謝及供能下降，心臟功能受損。因此，為達(dá)到心肌保護(hù)的目的，應(yīng)當(dāng)使自噬維持在適當(dāng)?shù)乃?。mTOR是調(diào)節(jié)自噬的重要靶點(diǎn)