肝郁證模型大鼠藍斑和腎上腺髓質TH、c-fos的表達及其調控機制的研究.pdf

1、背景：辨證論治作為中醫(yī)學的精髓,其在幾千年的臨床實踐中不斷發(fā)展和驗效,充分體現(xiàn)了傳統(tǒng)醫(yī)學整體觀和個體化的治療理念,是中醫(yī)學極具優(yōu)勢的部分。而“證”是辨證論治的依據(jù),是疾病處于一定階段病因、病位、病性和病勢的綜合,能體現(xiàn)患者的整體性特征,是中醫(yī)學現(xiàn)代化研究的核心內容。因此,證本質的研究對于中醫(yī)理論與臨床實踐的發(fā)展和中醫(yī)現(xiàn)代化具有極其重要的意義。
　　 肝郁證是指由于肝的疏泄功能異常、疏泄不及而致氣機郁滯所表現(xiàn)的證候,為病廣泛,常見

2、于臨床多種疾病中,是中醫(yī)臟腑證候中常見的證候之一,也是中醫(yī)肝病發(fā)病學的主要環(huán)節(jié)。研究肝郁證的實質,不僅是中醫(yī)證本質研究的重要內容,更能為臨床多種疾病的診斷和防治提供新的思路和方法。通過肝郁證這一典型證候的研究,探索證本質研究的合適方法,對闡釋中醫(yī)學的科學內涵有實際意義。
　　 經(jīng)過眾多學者多年的研究和探索,已初步證實肝郁證具有現(xiàn)代病理生理學基礎,并部分地闡釋了其中醫(yī)理論的科學性,取得了階段性成果:認為和應激密切相關,并且涉及機體

3、神經(jīng)、內分泌、循環(huán)、消化、免疫等多個系統(tǒng)。國外對應激所涉及的下丘腦-垂體-腎上腺皮質系統(tǒng)(HPA)、藍斑-交感-腎上腺髓質系統(tǒng)(LC-NE)等均研究較為全面。而在國內,雖然與神經(jīng)內分泌系統(tǒng)關系的研究是近幾年來肝郁證研究的熱點,但是多集中在HPA軸、下丘腦-垂體-甲狀腺軸(HPTA)或是下丘腦-垂體-性腺軸(HPGA)上,對LC-NE的研究尚未見報道。因此,本課題以LC-NE軸為切入點,希望能為進一步揭示肝郁證的本質和中醫(yī)基礎理論的實驗研

4、究作出一份貢獻。
　　 目的：采用慢性束縛應激的方法復制大鼠肝郁證模型,觀察肝郁模型大鼠在體重、行為學、血清學以及藍斑、腎上腺髓質中TH和c-fos蛋白及基因表達的變化,嘗試從LC-NE軸的角度對肝郁證的微觀辨證進行初步探討；比較逍遙散干預大鼠與模型大鼠之間的差異表達,一方面探討逍遙散對肝郁證的作用機理,另一方面以方測證、方證互參,說明肝郁證的本質。
　　 方法：
　　 1.慢性束縛肝郁大鼠模型的建立動物分組:實

5、驗用清潔級雄性SD大鼠36只,鼠齡5周,體重(150±20)g,適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為正常對照組(A組)、肝郁證逍遙散組(B組)、肝郁證模型組(C組),每組各12只。A組3只1籠,其余2組單籠孤養(yǎng)。
　　 模型建立:參照文獻,模擬中醫(yī)情志抑郁的病因,將B、C組大鼠置于特制的束縛制動筒內,固定其身體與尾部,使之不能隨意活動。每日開始時間隨機,每日束縛制動1次,持續(xù)時間從第1天的1h逐漸增至每天6h,連續(xù)21d。B、C組大鼠在束縛

6、制動期間禁食、禁水。A組大鼠不予任何干預。
　　 藥物干預:B組大鼠根據(jù)正常成人逍遙散每日用量,按體表面積換算成大鼠用藥量為10g/kg.d,根據(jù)大鼠個體體重每日下午16時給B組大鼠經(jīng)胃灌相應藥量,A、C組大鼠同時以生理鹽水灌胃。
　　 從液體消耗、行為學、實驗室檢查血清NE、逍遙散干預后療效觀察等方面評價模型的可靠性。
　　 2.運用HE染色方法,觀察大鼠LC、腎上腺髓質的形態(tài)學改變。
　　 3.用免疫

7、組化法檢測LC、腎上腺髓質中TH和c-fos的表達變化。用Imageproplus6.0軟件進行分析。
　　 4.運用RT-PCR技術檢測TH、c-fos的mRNA在LC、腎上腺髓質中的表達變化。
　　 5.所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計分析。
　　 結果：
　　 1.從一般狀況來看,C組大鼠開始表現(xiàn)為易激惹、掙扎,隨后表現(xiàn)表現(xiàn)為倦怠少動、喜歡貼壁、叫聲尖細、反應遲緩、飲食減少,伴有毛色黯淡易

8、于脫落、大便顆粒松散等肝郁證的表現(xiàn)。B組大鼠上述反應較輕,而A組未見異常行為狀態(tài)。各組間體重增長存在顯著差異(P=0.000),C組生長較為緩慢,B組服藥后體重增長緩慢的情況得到改善。液體消耗實驗提示各組間糖水偏好存在顯著性差異(P=0.000),C組的糖水偏好率明顯小于其它兩組。曠場實驗發(fā)現(xiàn)C組的直立次數(shù)、理毛次數(shù)和穿越格數(shù)均顯著低于A組(P<0.01)。血清NE發(fā)現(xiàn):C組的血清NE濃度明顯高于A組(P<0.01)。說明慢性束縛應激確

9、能造成大鼠的肝郁證,能有效的模擬臨床中肝郁證興趣喪失、快感缺乏等癥狀。
　　 2.由HE染色顯示,B、C組大鼠LC、腎上腺髓質無明顯的形態(tài)學改變。
　　 3.免疫組化法檢測LC、腎上腺髓質中TH和c-fos的表達變化,發(fā)現(xiàn)C組TH和c-fos的陽性神經(jīng)元數(shù)目均大于A組(P<0.05),染色強度也明顯增強,平均光密度值也明顯高于A組(P<0.05)。經(jīng)逍遙散干預的B組有下調二者表達的作用。
　　 4.運用RT-PC

10、R技術檢測TH、c-fos的mRNA在LC、腎上腺髓質中的表達,發(fā)現(xiàn)與A組比較,C組THmRNA、c-fosmRNA的表達顯著增高(P<0.05),B組THmRNA、c-fosmRNA表達較C組明顯降低(P<0.05)。TH和c-fos的表達變化是相關的,兩者的表達趨勢具有相似性。
　　 結論：本次研究采用慢性應激束縛的方法,成功的復制了大鼠的肝郁證模型。證實在肝郁過程中,LC和腎上腺髓質TH均表達增強,提示LC和腎上腺髓質在應

11、激狀況下會釋放大量兒茶酚胺,作用于相應受體或靶器官,參與對神經(jīng)內分泌系統(tǒng)和代謝功能的調節(jié),以適應機體應激產(chǎn)生的反應。c-fos在LC和腎上腺髓質陽性細胞數(shù)量和平均光密度均比對照組增加,表達趨勢與TH一致,并在同一細胞能夠共表達,而且TH啟動子上具有c-fos的作用位點,表明c-fos在慢性束縛應激過程中參與了LC和腎上腺髓質TH的表達調控。首次從藍斑-交感-腎上腺髓質系統(tǒng)對肝郁證進行研究,為進一步研究肝郁證的分子機制提供了理論基礎,也為