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文檔簡(jiǎn)介
1、腸缺血再灌注(intestihal ischemia reperfusion,IIR)損傷是臨床外科常見(jiàn)的危急重癥之一,常發(fā)生于急性腸系膜缺血、嚴(yán)重?zé)齻?、失血、?chuàng)傷和感染性休克,以及腹主動(dòng)脈瘤和小腸移植等復(fù)雜的外科手術(shù)治療過(guò)程中。腸缺血再灌注損傷是系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatory response syndrome,SIRS)和多器官功能障礙綜合征(multivle organ dysfunction sy
2、ndrome,MODS)的始動(dòng)因素,具有極高的發(fā)病率和死亡率。繼發(fā)于小腸移植術(shù)后的腸缺血再灌注損傷還會(huì)進(jìn)一步加重免疫排斥反應(yīng),并最終導(dǎo)致小腸移植的失敗。腸缺血再灌注損傷的預(yù)防和治療是外科臨床面臨的重要問(wèn)題。
腸缺血再灌注損傷的危害不僅局限于腸道本身,同時(shí)它還會(huì)引起嚴(yán)重的遠(yuǎn)隔臟器損傷,其機(jī)制復(fù)雜。其中,腸道屏障功能被破壞,菌群移位,毒性物質(zhì)如炎癥介質(zhì)、細(xì)菌毒素等釋放入血,活性氧自由基(reactiveoxygen speci
3、es,ROS)被激活,形成氧化應(yīng)激,是損傷機(jī)制中極為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。我們和其他學(xué)者的研究表明,這種氧化應(yīng)激和炎癥介質(zhì)所引起的遠(yuǎn)隔器官損傷的病理生理過(guò)程是通過(guò)多種分子機(jī)制和細(xì)胞因子的參與完成的,多種信號(hào)通路參與其中,包括:1.核因子KB(nuclear factor kappaB,NFKB)的活化;2.泛素.蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system,UPS)的作用;3.髓樣細(xì)胞表達(dá)的觸發(fā)受體-1(Triggerin
4、g ReceptorExvressed on Myeloid Cells1,TREM-1)信號(hào)通路的作用:4.聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(Poly(ADP-ribose)polymerase1,PARP-1)信號(hào)通路的作用等。研究發(fā)現(xiàn),在各種信號(hào)通路被ROS激活并產(chǎn)生炎癥放大的同時(shí),另外一些基因蛋白也可能被活化并產(chǎn)生保護(hù)作用。
轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(transcription factor NF-E2-relate
5、dfactor-2,Nrf2)是一種重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)因子,生理狀態(tài)下定位于細(xì)胞漿,與胞質(zhì)接頭蛋白(Kelch-like ECH associating protein1,Keap-1)結(jié)合形成復(fù)合物。當(dāng)受到氧化應(yīng)激、親電子試劑等的刺激后,迅速解離出來(lái)并活化轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核,與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidantresponse element,ARE)結(jié)合,進(jìn)而誘導(dǎo)其調(diào)控的靶基因表達(dá)血紅素加氧酶1(heme oxygenas
6、e1,HO-1)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-Px)和NAD(P)H:醌氧化還原酶1(NAD(P)H:quinoneoxidoreductase1,NQ01)等抗氧化和解毒酶,從而對(duì)抗ROS引發(fā)的氧化應(yīng)激。因此,調(diào)控Nrf2-ARE信號(hào)通路可能是預(yù)防和治療氧化應(yīng)激所致疾病的重要手段和方法。
隨著Nrf2-ARE信號(hào)通路能夠減輕ROS損害作用的發(fā)現(xiàn),有學(xué)者對(duì)其在臟器缺血再灌注損傷中
7、的保護(hù)作用進(jìn)行了相關(guān)研究,研究顯示,Nrf2-ARE信號(hào)通路對(duì)于心、腦和腎臟缺血再灌注損傷具有重要的保護(hù)作用,但其在腸缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用尚不清楚。
萊菔硫烷(Sulforaphane,SFN)是一種異硫氰酸鹽,主要來(lái)源于綠花椰菜一類的十字花科蔬菜,具有抗氧化、抗腫瘤等生物學(xué)特性,作為化學(xué)預(yù)防藥物已引起廣大研究者的關(guān)注。該化合物是已知的Nrf2重要的激活劑,能夠誘發(fā)Nrf2活化轉(zhuǎn)位入核,與ARE結(jié)合,正向調(diào)控Ⅱ相解毒
8、酶的表達(dá),清除ROS。近年來(lái)研究開(kāi)發(fā)的中藥活性成分表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)是從綠茶中提取的主要的活性和水溶性成分,是兒茶素中含量最高的組分,具有抗氧化作用。
本研究采用大鼠腸缺血再灌注模型,應(yīng)用已知藥物誘導(dǎo)激活Nrf2-ARE信號(hào)通路,探討Nrf2-ARE信號(hào)通路對(duì)于腸缺血再灌注腸道及遠(yuǎn)隔臟器損傷的保護(hù)作用,再進(jìn)一步驗(yàn)證中藥活性成分EGCG預(yù)處理對(duì)腸缺血再灌注多
9、臟器損傷的保護(hù)作用,以期為腸缺血再灌注多臟器損傷的預(yù)防和治療提供一種新的靶點(diǎn),同時(shí)也為EGCG的開(kāi)發(fā)利用提供更有利的理論依據(jù)。
第一部分:Nrf2-ARE信號(hào)通路在大鼠腸缺血再灌注損傷中的作用
目的:通過(guò)分析Nrf2-ARE信號(hào)通路誘導(dǎo)藥物預(yù)處理對(duì)腸道Nrf2和HO-1的表達(dá)和對(duì)氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響,研究Nrf2-ARE信號(hào)通路在大鼠腸缺血再灌注(IIR)損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制,為IIR損傷提供一種新的預(yù)防和治
10、療靶點(diǎn)。
方法:32只雄性SD大鼠隨機(jī)分為control組、SFN control組、IIR組和SFN+IIR組,通過(guò)夾閉腸系膜上動(dòng)脈(superior mesenterie artery,SMA)60 min、再灌注120 min,建立IIR損傷模型。預(yù)處理組于缺血前30分鐘分別以5 mg/kg SFN行腹腔注射,對(duì)照組僅行剖腹術(shù)及SMA分離術(shù)。再灌注結(jié)束后,取小腸組織。觀察大鼠腸組織形態(tài)學(xué)和病理學(xué),測(cè)定小腸組織勻漿超氧
11、化物岐化酶(SOD)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)、谷胱甘肽(GSH)、GSH-Px,采用免疫組化法觀察小腸組織Nrf2和HO-1表達(dá)并用Western-blot法進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證。
結(jié)果:1.與control相比,IIR組:(1)小腸粘膜及粘膜下出現(xiàn)水腫、出血,小腸粘膜缺損、斷裂(P<0.01);(2)小腸組織SOD活性降低(P<0.01),MFO活性增強(qiáng)(P<0.01);(3)小腸組織GSH水平均顯著降低(P<0.01);(4)
12、小腸組織Nrf2、HO-1表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01.P<0.01)。2.與cortrol相比,SFN control組:(1)小腸組織GSH-Px水平明顯增加(P<0.01);(2)小腸組織中Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)增多(P<0.01,P<0.01)。3.與IIR組相比,SFN+IIR組:(1)小腸組織的病理表現(xiàn)及損傷程度明顯減輕(P<0.05);(2)小腸組織勻漿SOD活性升高(P<0.05),MPO活性降低(P<0.05);(3)
13、小腸組織GSH和GSH-Px水平明顯升高(P<0.05,P<0.01);(4)小腸組織Nrf2、HO-1表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01,P<0.05)。
結(jié)論:腸缺血1小時(shí)再灌注2小時(shí)可導(dǎo)致明顯的小腸組織損傷,表現(xiàn)為小腸擴(kuò)張,腸粘膜及粘膜下水腫、出血,粘膜缺損、斷裂,氧化應(yīng)激指標(biāo)增加和抗氧化應(yīng)激指標(biāo)的降低。通過(guò)Nrf2-ARE信號(hào)通路誘導(dǎo)藥物預(yù)處理后,增加了小腸組織Nrf2和HO-1的表達(dá),同時(shí)伴有小腸組織損傷的減輕,氧化應(yīng)激指標(biāo)
14、降低和抗氧化應(yīng)激指標(biāo)的升高,說(shuō)明Nrf2信號(hào)通路參與了腸缺血再灌注損傷的保護(hù)過(guò)程,Nrf2-ARE信號(hào)通路在大鼠腸缺血再灌注(IIR)腸道損傷中起保護(hù)作用。
第二部分:SFN在大鼠腸缺血再灌注肝、肺損傷中的保護(hù)作用
目的:通過(guò)分析已知藥物SFN預(yù)處理誘導(dǎo)Nrf2-ARE信號(hào)通路對(duì)IIR動(dòng)物模型肝、肺組織Nrf2和HO-1的表達(dá)和對(duì)氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響,研究SFN通過(guò)誘導(dǎo)Nrf2-ARE信號(hào)通路產(chǎn)生對(duì)大鼠IIR引
15、發(fā)的遠(yuǎn)隔臟器肝、肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。
方法:32只雄性SD大鼠隨機(jī)分為control組、SFN control組、IIR組、SFN+IIR組,通過(guò)夾閉SMA60 min、再灌注120 min,建立IIR損傷模型。預(yù)處理組于缺血前30分鐘分別以5 mg/kg SFN行腹腔注射,對(duì)照組僅行剖腹術(shù)及SMA分離術(shù)。再灌注結(jié)束后,取肝、肺組織。觀察大鼠肝、肺組織形態(tài)學(xué)和病理學(xué),檢測(cè)肝功能:血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨
16、酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST):測(cè)定肺組織支氣管肺泡灌洗液蛋白(brochia alveolus lung fluid protein,BALFP);測(cè)定肝、肺組織勻漿SOD、MPO、GSH、GSH-Px,采用免疫組化法觀察肝、肺組織Nrf2和HO-1表達(dá)并用Western-blot法檢測(cè)驗(yàn)證。
結(jié)果:1.腸缺血再灌注誘發(fā)了肝、肺損傷,表現(xiàn)為與control相比,IIR組:(1)血清ALT、AST明顯升高(P<0.01,P<0.0
17、1);(2)肺組織BALFP增高(P<0.01);(3)肝、肺組織出現(xiàn)明顯的水腫、出血和炎細(xì)胞浸潤(rùn);(4)肝、肺組織SOD活性降低(P<0.01,P<0.05),MPO活性增強(qiáng)(P<0.01,P<0.05);(5)肝、肺組織GSH水平均顯著降低(P<0.01,P<0.05);(6)肝、肺組織HO-1表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01,P<0.01);(7)肝、肺組織Nrf2表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05,P<0.01)。2.與control相比,SFN c
18、ontrol組:(1)肝、肺組織GSH-Px水平明顯增加(P<0.05,P<0.01);(2)肝、肺組織中HO-1表達(dá)增多(P<0.05,P<0.01);(3)肝、肺組織中Nrf2表達(dá)增多(P<0.05,P<0.01)。3.與IIR組相比,SFN+IIR組:(1)肝損傷減輕,血清ALT、AST明顯減低(P<0.01,P<0.05);(2)肺損傷減輕,肺組織BALFP降低(P<0.05);(3)肝、肺組織的病理表現(xiàn)及損傷程度明顯減輕;(4
19、)肝、肺組織勻漿SOD活性升高(P<0.01,P<0.05),MPO活性降低(P<0.01,P<0.05);(5)肝、肺組織GSH水平明顯升高(P<0.05,P<0.01);(6)肝、肺組織GSH-Px水平明顯升高(P<0.05,P<0.01);(7)肝、肺組織HO-1表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01,P<0.01);(8)肝、肺組織Nrf2表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05,P<0.05)。
結(jié)論:IIR引發(fā)遠(yuǎn)隔臟器肝、肺損傷,表現(xiàn)為肝、肺組
20、織水腫、出血和炎細(xì)胞浸潤(rùn),SFN預(yù)處理后,激發(fā)活化Nrf2-ARE信號(hào)通路,肝、肺組織Nrf2、HO-1表達(dá)增加,抑制了組織炎性浸潤(rùn)及氧化應(yīng)激,肝、肺組織病理?yè)p傷的程度減輕,說(shuō)明SFN通過(guò)激發(fā)活化Nrf2-ARE信號(hào)通路對(duì)大鼠IIR引發(fā)的遠(yuǎn)隔臟器肝、肺損傷起保護(hù)作用。
第三部分:EGCG在大鼠腸缺血再灌注肝、肺損傷中的保護(hù)作用
目的:研究EGCG對(duì)大鼠腸缺血再灌注肝、肺損傷的保護(hù)作用,探討其是否具有與SFN相
21、同的Nrf2-ARE信號(hào)通路激活作用,從而對(duì)腸缺血再灌注肝、肺損傷產(chǎn)生保護(hù)作用,為EGCG的開(kāi)發(fā)利用提供更有利的理論依據(jù)。
方法:32只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、EGCG control組、IIR組、EGCG+IIR組,通過(guò)夾閉腸系膜上動(dòng)脈60 min、再灌注120 min,建立IIR損傷模型。預(yù)處理組于缺血前30分鐘分別以50 mg/kg EGCG行腹腔注射,對(duì)照組僅行剖腹術(shù)及SMA分離術(shù)。再灌注結(jié)束后,取肺組織。觀察
22、大鼠肝、肺組織形態(tài)學(xué)和病理學(xué),檢測(cè)肝功能:ALT、AST:測(cè)定肺組織含水率:測(cè)定肝、肺組織勻漿SOD、MPO、GSH、GSH-Px,采用免疫組化法觀察肝、肺組織Nrf2和HO-1表達(dá)并用Western-blot法檢測(cè)驗(yàn)證。
結(jié)果:1.腸缺血再灌注誘發(fā)了肝、肺損傷,與對(duì)照組相比,IIR組:(1)血清ALT、AST明顯升高(P<0.01,P<0.05);(2)肺組織含水率增高(P<0.01);(3)肝、肺組織出現(xiàn)明顯的水腫、出
23、血和炎細(xì)胞浸潤(rùn);(4)肝、肺組織SOD活性降低(P<0.01,P<0.01),MPO活性增強(qiáng)(P<0.01,P<0.01);(5)肝、肺組織GSH水平均顯著降低(P<0.05,P<0.05);(6)肝、肺組織HO-1表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01,P<0.01);(7)肝、肺組織Nrf2表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05,P<0.05)。2.與對(duì)照組相比,EGCG control組:(1)肝、肺組織GSH-Px水平明顯增加(P<0.01,P<0.01);(
24、2)肝、肺組織中HO-1表達(dá)增多(P<0.01,P<0.01);(3)肝、肺組織中Nrf2表達(dá)增多(P<0.05,P<0.01)。3.與IIR組相比,EGCG+IIR組:(1)肝損傷減輕,血清ALT、AST明顯減低(P<0.01,P<0.05);(2)肺損傷減輕,肺組織含水率降低(P<0.01);(3)肝、肺組織的病理表現(xiàn)及損傷程度明顯減輕;(4)肝、肺組織勻漿SOD活性升高(P<0.01,P<0.05),MPO活性降低(P<0.01,
25、P<0.01);(5)肝、肺組織GSH水平明顯升高(P<0.01,P<0.01);(6)肝、肺組織GSH-Px水平明顯升高(P<0.01,P<0.01);(7)肝、肺組織HO-1表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01,P<0.01);(8)肝、肺組織Nrf2表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01,P<0.05)。
結(jié)論:IIR引發(fā)遠(yuǎn)隔臟器肝、肺損傷,表現(xiàn)為肝、肺組織水腫、出血和炎細(xì)胞浸潤(rùn),通過(guò)EGCG預(yù)處理,有效降低了肝、肺損傷的程度,同時(shí)肝、肺組織Nr
26、f2、HO-1表達(dá)增加。實(shí)驗(yàn)證明,天然中草藥綠茶的有效活性成分EGCG,具有與已知藥物SFN相同的作用效果,通過(guò)激發(fā)活化Nrf2-ARE信號(hào)通路,對(duì)大鼠腸缺血再灌注遠(yuǎn)隔臟器肝、肺損傷具有保護(hù)作用。
本研究利用大鼠腸缺血再灌注模型,采用生化自動(dòng)分析、免疫組化和Western blot分析等分子生物學(xué)方法對(duì)原發(fā)臟器腸道,以及遠(yuǎn)隔臟器肝、肺功能(AST、ATL、肺含水率和BALFP);腸、肝、肺組織氧化損傷水平(SOD);白細(xì)胞
27、趨化因子(MPO):Nrf2的激活表達(dá)和Ⅱ相抗氧化反應(yīng)酶系統(tǒng)(GSH、GSH-Px、HO-1)進(jìn)行了檢測(cè),探討Nrf2-ARE信號(hào)通路在腸缺血再灌注損傷保護(hù)機(jī)制中的作用,以及SFN和EGCG預(yù)處理對(duì)腸缺血再灌注腸道及遠(yuǎn)隔臟器損傷的保護(hù)作用。
結(jié)果表明:腸缺血再灌注不但能夠?qū)е略l(fā)臟器腸道的損傷,還能夠引起遠(yuǎn)隔臟器肝、肺組織的損傷。病理學(xué)表現(xiàn)為腸、肝、肺組織的出血、滲出、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);組織結(jié)構(gòu)破壞;肝功能受損;肺組織含水率
28、和BALFP增加;腸、肝和肺組織中的氧化損傷指標(biāo)和炎癥性指標(biāo)如:SOD含量下降,MPO的含量增加。采用SFN和EGCG預(yù)處理后,腸、肝和肺組織Nrf2的核表達(dá)增強(qiáng),Nrf2-ARE信號(hào)通路被激活,Ⅱ相抗氧化反應(yīng)酶系統(tǒng)的水平增加,腸、肝和肺組織損傷程度明顯減輕,說(shuō)明Nrf2-ARE信號(hào)通路對(duì)于腸缺血再灌注腸道損傷及遠(yuǎn)隔臟器肝、肺損傷起保護(hù)作用,同時(shí),進(jìn)一步驗(yàn)證了天然中草藥綠茶的有效活性成分EGCG,可以誘導(dǎo)活化Nrf2-ARE信號(hào)通路,對(duì)
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