利用Red系統(tǒng)構(gòu)建人組織型纖溶酶原激活劑突變體BAC乳腺特異表達(dá)載體.pdf

1、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)是治療血栓栓塞性疾病的重要藥物。本項(xiàng)目的t-PA突變體，活性提高，半衰期延長，已成功獲得表達(dá)。目前t-PA主要來自于哺乳動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)，成本高昂，價格昂貴。利用動物乳腺生物反應(yīng)器來生產(chǎn)不僅維持生產(chǎn)的成本低，而且產(chǎn)量高，能夠進(jìn)行翻譯后修飾、正確折疊。但位置效應(yīng)的影響是其主要技術(shù)瓶頸之一。細(xì)菌人工染色體容量大，可裝載乳蛋白基因的所有調(diào)控序列，乳蛋白基因座中的一些邊緣序列具有絕緣子的功效，能使乳蛋白基因表達(dá)

2、調(diào)控不受周圍序列的影響，作為轉(zhuǎn)基因載體就有可能克服外源基因的位置效應(yīng)。 本研究主要構(gòu)建了由β-酪蛋白基因調(diào)控序列指導(dǎo)的t-PA突變體BAC轉(zhuǎn)基因載體。采用了λ噬菌體Red同源重組系統(tǒng)介導(dǎo)的同源重組方法對含有鼠β-酪蛋白基因的RPCI23-440C1BAC進(jìn)行了快速改構(gòu)。這種方法要明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的——利用微生物本身的RecA重組系統(tǒng)進(jìn)行重組的方法。首先通過PCR方法，獲得兩端帶有鼠β-酪蛋白基因同源序列的tPAm-Zeo和tPAm-

3、BGHpA-Zeo同源重組片段，將其電擊轉(zhuǎn)化至已含有編碼Red重組酶質(zhì)粒和BAC的宿主菌。在λRed重組系統(tǒng)的幫助下，通過同源重組片段兩端與β-酪蛋白同源的序列在體內(nèi)與β-酪蛋白基因發(fā)生同源重組，將其置換。經(jīng)Southernblot和測序鑒定，得到了t-PAm基因定點(diǎn)敲入的tPAm-Zeo/tPAm-BGHpA-ZeoBAC轉(zhuǎn)基因載體。最后通過FLP位點(diǎn)專一性重組，利用Zeocin抗性基因兩側(cè)的FRT位點(diǎn)，將抗性基因剔除。Souther