重組人抗PAI抑制作用的新型纖溶酶原激活劑突變體的表達(dá)與活性研究.pdf

1、血栓性急性心腦血管病是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。目前在治療這類疾病方面已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，溶栓治療是其中最為重要的技術(shù)之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界每年死于該類疾病的患者大約有1600萬人，我國每年患有這類疾病的人數(shù)也有500萬人。因此，研發(fā)出新的高效的溶栓藥物受到越來越多研究機(jī)構(gòu)的重視。
　　組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，t-PA)是纖溶系統(tǒng)的生理性激活劑，由于t-PA與血栓基質(zhì)

2、纖維蛋白有很強(qiáng)的特異性親和力，能有效地在血栓局部激活纖溶酶原為纖溶酶而使血栓溶解。重組t-PA是利用基因工程技術(shù)開發(fā)出的用于治療心腦血管病的特效藥，與鏈激酶、尿激酶等溶栓劑比較具有作用快、不造成全身的纖維蛋白溶解、療效高等優(yōu)點(diǎn)，但是在臨床應(yīng)用中也有很多不足，如在體內(nèi)可被肝細(xì)胞迅速清除，在血漿中存在纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)可快速抑制其活性。t-PA在血中的半衰期很短(1～5 min)，使臨床溶栓治療時(shí)為維持有效濃度需大劑量(

3、100～150 mg)，增加了系統(tǒng)性纖溶引起出血的危險(xiǎn)。由德國的勃林格殷格翰(BoehringerIngelheim)制藥公司生產(chǎn)的瑞替普酶(rt-PA)和阿替普酶(CHO-t-PA)，已經(jīng)成功投放市場(chǎng)用于治療血栓性疾病。首先它們?cè)隗w內(nèi)的半衰期延長到了18min，且增強(qiáng)了與纖維蛋白的結(jié)合力，并且還是可逆結(jié)合，大大提高了激活纖溶酶原的活性。其次可通過靜脈給藥，且降低了用藥劑量。但是它們的分子結(jié)構(gòu)中有PAI-1的結(jié)合位點(diǎn)，血液中的PAI-1

4、與其結(jié)合從而抑制纖溶活性。有國外文獻(xiàn)報(bào)道血栓性疾病患者血中PAI-1濃度高于正常人，體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了5 U·mL-1的PAI-1可以使5ng·mL-1 rt-PA和天然CHO-t-PA失活，所以臨床用量仍較高。
　　因此研制半衰期長且活性不受PAI-1抑制、用量小、成本低、副作用小的t-PA突變體成為當(dāng)務(wù)之急，本實(shí)驗(yàn)室在重組t-PA的基礎(chǔ)上使PAI-1位點(diǎn)的堿基突變，去除了指狀區(qū)、表皮生長因子區(qū)和Kringle1區(qū)，使含有373-

5、384 PAI-1結(jié)合位點(diǎn)的rt-PA的基因序列AAG CAC AGGAGG突變?yōu)镚CG GCC GCG GCG，氨基酸KHRR相應(yīng)變?yōu)锳AAA，構(gòu)建了新的t-PA突變體，并克隆于大腸桿菌表達(dá)載體。本研究構(gòu)建pBV220-t-PA重組表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)DNA測(cè)序確認(rèn)后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，溫控誘導(dǎo)表達(dá)，凝膠過濾法對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行初步純化，復(fù)性后，過刺桐胰蛋白酶親和層析柱純化，酶動(dòng)力學(xué)分析其活性。測(cè)序證實(shí)t-PA突變體的DNA序列正確，表達(dá)