轉基因兔乳腺特異性表達重組人纖溶酶原激活劑(rhPA)及其藥效學研究.pdf

1、自上世紀以來，血栓性疾病一直是危害人類健康和生命安全的頭號因素，溶栓療法是目前臨床上使用最廣泛而有效的一種治療方法，而且溶栓藥物已經歷了三代發(fā)展。人組織纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen activator, t-PA)是由血管內皮細胞合成并分泌的一種絲氨酸蛋白酶，能夠高效特異地溶解血栓，是一種良好的第二代溶栓藥物。重組人纖溶酶原激活劑(recombinant human plasminogen activa

2、tor,rhPA)是天然t-PA的重組突變體，屬于新型第三代溶栓藥物，具有較天然t-PA更加優(yōu)越的溶栓功能。利用動物乳腺生物反應器來生產t-PA及其重組突變體，具有產量高、成本低、翻譯后修飾、生物活性高等優(yōu)于其它表達系統(tǒng)的特點。應用多種純化技術相結合的策略，能夠方便、快捷、高效地將目標蛋白從動物乳汁中分離純化出來。現(xiàn)今，國內外已有很多關于以上研究內容的報道。
　　本研究目的旨在:將構建正確而有效的rhPA乳腺特異性表達載體（F、E

3、、K1區(qū)缺失重組體t-PA）應用到轉基因兔中，研究其表達水平和活性功能，以期獲得高效表達rhPA的轉基因兔;研究各種分離純化表達兔乳中rhPA的方法和策略，以期獲得高純度、高回收率、高活性的rhPA;研究小鼠血栓和溶栓模型，以期獲得最佳的動物溶栓效果;同時，還研究了rhPA單克隆抗體的制備和篩選方法，以期獲得能夠用作親和層析配體的多羥基反應單克隆抗體(PR-mAb)。從而，最終獲得一種新穎、高效的溶栓藥物。相關研究方法和結果如下:

4、>　　1.采用常規(guī)分子生物學技術，分別以山羊β-酪蛋白基因(β-casein)、山羊β-乳球蛋白基因(BLG)和牛αsl酪蛋白基因(αs1-casein)作為調控元件，以天然t-PA的F、E、K1區(qū)缺失體作為編碼蛋白序列，構建了乳腺特異性表達載體PCL25/rhPA、BLC14/rhPA和AP/rhPA。經酶切圖譜和測序比對結果顯示，構建的載體與理論序列完全一致。
　　2.通過膠原酶消化組織法建立山羊乳腺上皮細胞分離培養(yǎng)體系，電轉

5、染三種載體，經600μg/mL G418篩選兩周后，挑取生長旺盛、狀態(tài)較好的單克隆細胞集落，傳代擴大培養(yǎng)。經PCR檢測，PCL25/rhPA、BLC14/rhPA、AP/rhPA三種載體分別獲得了79株、66株、63株整合陽性單克隆細胞株，并應用5μM催乳素進行誘導表達。ELISA檢測72h后細胞誘導上清液，25株轉PCL25/rhPA基因細胞株高水平表達rhPA，3株轉BLC14/rhPA基因細胞株表達rhPA，而轉AP/rhPA基因

6、細胞株未見表達。經纖維蛋白平板溶圈法(FAPA)檢測，所有誘導表達上清液均具有體外溶栓活性功能。結果表明，在細胞水平，PCL25/rhPA和BLC14/rhPA載體能夠有效地驅動rhPA基因特異性表達，且PCL25/rhPA載體的表達水平明顯高于其它兩種載體。從而，驗證了構建的PCL25/rhPA載體是合理而有效的。
　　3.將以上三個構建(PCL25/rhPA、BLC14/rhPA、AP/rhPA)經顯微注射導入到兔受精卵中，共

7、移植94只受體，妊娠71只，出生319只仔兔，PCR檢測85只為轉基因整合陽性兔，妊娠率為75.5％(71/94)，整合率為26.6％(85/319)。ELISA檢測57只存活轉基因兔（或后代）乳汁，共12只乳腺特異性表達rhPA（PCL25/rhPA11只，BLC14/rhPA1只），表達水平約在5.2-630μg/mL之間。SDS-PAGE電泳和Westem Blot檢測該12只兔乳，均出現(xiàn)約39KDa大小的目標特異性條帶。FAPA

8、結合ELISA測定表達產物的體外溶栓比活性，最高可達360倍左右（A29，與阿替普酶相比）。測交檢測高表達水平的A29系轉基因兔，1只F2代(A29F2-09)的所有后代仔兔均為整合陽性(100％，13/13); Real-time PCR檢測相對拷貝數(shù)，該只兔約是其它同系轉基因兔的2倍。從而，證明了A29F2-09為純合子轉基因兔，且rhPA表達水平約1000μg/mL，明顯高于非純合子兔;不同系轉基因兔拷貝數(shù)與表達水平間沒有相關性。

9、以上結果表明，PCL25/rhPA載體能夠在轉基因兔乳腺中高效表達活性rhPA;表達水平主要與整合位點有關;當整合位點一致時，表達水平隨拷貝數(shù)的增加也相應地累積提高。
　　4.通過傳統(tǒng)弗氏佐劑和快速免疫佐劑兩種方法免疫小鼠，結果顯示在免疫小鼠血清效價、免疫原劑量和免疫周期上，快速免疫佐劑都大大地優(yōu)越于弗氏佐劑(1010/109，20μg/1300μg，35d/70d)。通過電脈沖和化學PEG兩種方法將免疫后的小鼠脾臟淋巴細胞與SP

10、2/0小鼠骨髓瘤細胞融合，結果顯示電融合效率明顯高于化學PEG融合(166％/88.4％)。通過HAT和HT篩選及有限稀釋法亞克隆后，共獲得12株能夠穩(wěn)定分泌高效價抗體的雜交瘤細胞株（標號C1-C12）。ELISA-elution檢測，有3株為多羥基反應單克隆抗體(PR-mAb，標號C1、C4、C8)，占單克隆抗體總數(shù)的25％(3/12)。小鼠腹腔誘導法大量制備抗體，C1、C4、C8株腹水效價分別是108、1010、108，且無交叉非特

11、異性反應，能夠為親和層析所用。
　　5.通過離心脫脂、35％飽和硫酸銨沉淀、超濾及透析等方法進行兔乳前處理，獲得粗純樣品。將C4株抗體與CNBr activated Bestarose4FF偶聯(lián)來制備免疫親和層析柱，偶聯(lián)率高達96.5％。嘗試五種不同的洗脫液(A:0.1mol/L甘氨酸，pH2.5;B:0.1mol/L甘氨酸，pH3.5;C:0.1mol/L甘氨酸，pH5.0; D:0.75mol/L硫酸銨+40％丙二醇的TE緩沖

12、液，pH7.9;E:0.2MNaH2P04-檸檬酸，pH2.2），來探索最佳洗脫效果的條件，結果顯示0.75mol/L硫酸銨+40％丙二醇的TE緩沖液(pH7.9)洗脫效果最佳，但pH較低的強酸緩沖液(A、B、E)也能夠達到洗脫要求，而pH較高的C洗脫液則出現(xiàn)雜蛋白較多且回收率低。再嘗試Chromdex75prep grade凝膠過濾預裝柱來進一步分離純化目標蛋白rhPA，上樣體積為1％和2.5％能夠將目標蛋白完全分開，出現(xiàn)兩個獨立的峰

13、;而上樣體積為5％則不能夠將目標蛋白完全分開，出現(xiàn)兩個相互交叉重疊峰。經免疫檢測及飛行時間質譜鑒定該純化產物為目標rhPA。與BSA對照品相比，雙向電泳結果顯示，純化產物的大小約39KDa（在35-40KDa之間），等電點約7.1（BSA等電點約4.7），純度可達96％-99％或更高（BSA純度96％-99％）。與阿替普酶對照品相比，圓二色譜分析顯示，該純化產物與阿替普酶有相似的二級結構;FAPA測定純化產物rhPA的體外溶栓比活性，其

14、值高達約214倍，遠遠高于阿替普酶溶栓藥。
　　6.以HitrapTM CaptoTM Q-1 mL離子交換柱去內毒素，經試劑盒測試，內毒素含量低于0.015EU/mL。分別以0.3mL/只小鼠腹腔注射1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％濃度的角叉菜膠，來探索誘導小鼠尾部血栓形成的最佳條件，結果顯示以0.05％濃度的角叉菜膠誘導小鼠尾部血栓形成條件最佳。以不同的“給藥”濃度（低劑量組0.1mg/只、中劑量組0.4mg/

15、只、高劑量組1.6mg/只及阿替普酶、生理鹽水對照組）對小鼠血栓模型病進行治療，結果顯示純化產物rhPA作為溶栓藥物治療小鼠尾部血栓，在效果和劑量上明顯優(yōu)越于阿替普酶，且rhPA高劑量組（1.6mg/只）在三次給藥后(32h)能夠完全治愈小鼠尾部血栓疾病。
　　以上結果表明，我們構建的F、E、K1區(qū)缺失重組體t-PA（PCL25/rhPA載體）是合理、有效的，且能夠在轉基因兔乳腺中高效表達;表達產物rhPA能夠相對單獨地存在于兔乳