Tet-On系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)c-myc轉(zhuǎn)基因小鼠及腫瘤模型的建立.pdf

1、Tet-Off/Tet-On系統(tǒng)是一種利用原核調(diào)控元件在真核細(xì)胞中定量并特異地控制外源基因表達(dá)的體系，它是用大腸桿菌Tn10轉(zhuǎn)座子中四環(huán)素操縱子原理來(lái)實(shí)施調(diào)控的。Tet-Off/Tet-On系統(tǒng)是比較成熟的真核生物外源基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)之一，具有高效、無(wú)毒、開(kāi)/關(guān)較嚴(yán)密等特點(diǎn)，已被成功地應(yīng)用于細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠基因誘導(dǎo)表達(dá)的研究。c-myc是一種原癌基因，它是禽類(lèi)骨髓瘤病毒v-myc的細(xì)胞同源序列，其編碼的蛋白是核內(nèi)特異性DNA結(jié)合蛋白。c

2、-myc加速了G1-S細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，形成腫瘤；還刺激細(xì)胞凋亡，c-myc是一個(gè)β細(xì)胞凋亡和嚙齒類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)胰島分泌減少的強(qiáng)有力的引發(fā)者。 本研究首先應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，從人的宮頸癌細(xì)胞中成功擴(kuò)增出預(yù)期大小為1.32Kb的c-myccDNA的特異性條帶。將擴(kuò)增產(chǎn)物提純后克隆入pTZ57R/T載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選及酶切鑒定后，獲得了該基因的克隆pTZ57R/T-c-myc。測(cè)序后將c-myc基因亞克隆入Tet-On系

3、統(tǒng)的pTRE2載體中，獲得pTRE2-c-myc重組載體。為了便于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選，我們將pCEP4上的Hyg酶切補(bǔ)平后克隆到同樣酶切補(bǔ)平的pTRE2-c-myc載體，獲得pTRE2-c-myc-Hyg。用pTet-On質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，通過(guò)G418篩選獲得表達(dá)Tet-On系統(tǒng)調(diào)節(jié)元件rtTA的陽(yáng)性細(xì)胞CHO-pTet-On，經(jīng)過(guò)有限稀釋法獲得16個(gè)轉(zhuǎn)pTet-On基因的細(xì)胞單克隆。RT-PCR檢測(cè)rtTA的表達(dá)后，將pTRE2-c-

4、myc-Hyg基因轉(zhuǎn)染能穩(wěn)定表達(dá)rtTA的單克隆細(xì)胞，潮霉素篩選獲得能誘導(dǎo)表達(dá)c-myc基因的CHO-pTet-On-pTRE2-c-myc-Hyg細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞亞克隆后得到轉(zhuǎn)pTet-On-pTRE2-c-myc-Hyg基因細(xì)胞的單克隆15個(gè)。強(qiáng)力霉素(DOX)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞后，RT-PCR、間接免疫熒光檢測(cè)到c-myc的表達(dá)。WesternBlot檢測(cè)到c-myc基因的表達(dá)與誘導(dǎo)物濃度有一定的效量關(guān)系。這些結(jié)果表明我們建立的四環(huán)素誘

5、導(dǎo)表達(dá)體系是有效的，可以用于c-myc基因體外的研究。在正常的培養(yǎng)條件下，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)pTet-On-pTRE2-c-myc-Hyg基因細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定，表明c-myc誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞生長(zhǎng)增殖快，并在測(cè)定72h，差異顯著，表明c-myc促進(jìn)細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期測(cè)定表明c-myc基因的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞由G1向S期過(guò)渡，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。但在低血清的條件下，轉(zhuǎn)pTet-On-pTRE2-c-myc-Hyg基因細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀和TUNEL檢測(cè)到凋亡，表明

6、c-myc促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 在體外細(xì)胞上驗(yàn)證Tet-On誘導(dǎo)c-myc基因表達(dá)系統(tǒng)可靠性的基礎(chǔ)上，我們利用pBC胰腺高表達(dá)啟動(dòng)子的載體，構(gòu)建含有Tet-On系統(tǒng)調(diào)節(jié)元件中的rtTA的重組載體pBC-rtTA。通過(guò)高保真酶PCR擴(kuò)增pTet-On上的rtTA基因，酶切rtTA，同時(shí)線(xiàn)形化pBC-SV40Tag載體(切去SV40Tag)，將rtTA克隆到pBC上獲得重組載體pBC-rtTA。將pBC-rtTA和pTRE2-c-myc經(jīng)

7、酶切線(xiàn)性化、純化后，顯微注射混合的雙基因到小鼠受精卵雄原核中。共注射603枚卵，將注射后存活263枚卵移植到21只受體母鼠的輸卵管中，17只母鼠懷孕，共產(chǎn)仔59只。PCR檢測(cè)得到3只founder轉(zhuǎn)基因鼠，其中轉(zhuǎn)pBC-rtTA、pTRE2-c-myc基因陽(yáng)性的公鼠2只(編號(hào)為6＃和14＃)，同時(shí)獲得轉(zhuǎn)pTRE2-c-myc單基因陽(yáng)性公鼠1只(編號(hào)為32＃)。SouthernBlot檢測(cè)證實(shí)了PCR檢測(cè)的結(jié)果。3只founder小鼠與正

8、常FVB配種，仔代經(jīng)PCR檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果符合孟德?tīng)栠z傳定律，證明外源基因穩(wěn)定遺傳給后代。轉(zhuǎn)pBC-rtTA、pTRE2-c-myc雙基因陽(yáng)性小鼠仔代經(jīng)DOX誘導(dǎo)后，RT-PCR檢測(cè)到1只founder的后代在其腦、心、肝、脾、腎、胃、腸、胰腺、生殖器部位表達(dá)c-myc基因。另1只founder的后代檢測(cè)不到c-myc基因的表達(dá)。我們獲得能誘導(dǎo)表達(dá)c-myc的轉(zhuǎn)pBC-rtTA、pTRE2-c-myc基因小鼠。 將轉(zhuǎn)pBC-rtT

9、A、pTRE2-c-myc基因陽(yáng)性且能表達(dá)c-myc的轉(zhuǎn)基因小鼠擴(kuò)大繁殖。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)pBC-rtTA、pTRE2-c-myc基因小鼠形態(tài)、行為的觀察，和對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖指標(biāo)、血液生理生化等指標(biāo)測(cè)定和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)以及組織切片的病理分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn)pBC-rtTA、pTRE2-c-myc基因小鼠經(jīng)DOX誘導(dǎo)后，與正常的小鼠以及未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)雙基因小鼠相比，其形態(tài)和行為，肉眼觀察未見(jiàn)異常；生長(zhǎng)發(fā)育方面：體重要顯著低于正常的FVB小鼠和

10、出生后未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠；同時(shí)在腸道長(zhǎng)度的比較方面得到DOX誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠的大腸和小腸的長(zhǎng)度略低于正常小鼠和轉(zhuǎn)基因未誘導(dǎo)的小鼠；其它臟器和繁殖指標(biāo)測(cè)定結(jié)果差異不顯著；淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)顯示DOX誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)pBC-rtTA、pTRE2-c-myc基因小鼠指標(biāo)高于正常小鼠和不誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠但差異不顯著；血液生物化學(xué)指標(biāo)和血液生理指標(biāo)差異也不顯著；組織切片病理分析，轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)后與正常小鼠和未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠相比腎出現(xiàn)病變，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、

11、腎小管腔狹窄，腎小球腎炎。 我們用胰腺高表達(dá)的啟動(dòng)子啟動(dòng)rtTA表達(dá)，再用其調(diào)控c-myc在轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達(dá)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的誘導(dǎo)，RT-PCR在胰腺、腎、脾、肝等臟器上檢測(cè)到了c-myc基因的表達(dá)，出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育較慢?？赡苡捎赾-myc促細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的影響?？紤]到c-myc雙向功能，我們用另一個(gè)促細(xì)胞增殖的因子刺激c-myc以使其發(fā)揮促細(xì)胞增殖的作用，來(lái)建立腫瘤模型。本實(shí)驗(yàn)室已建立了pTet-On、pTRE2-SV40Tag轉(zhuǎn)基

12、因小鼠。SimianVirus40(SV40)屬于多瘤病毒屬，SV40Tag具有致瘤性。我們利用制作的轉(zhuǎn)pTRE2-c-myc單基因陽(yáng)性小鼠與pTet-On、pTRE2-SV40Tag轉(zhuǎn)基因小鼠配種，獲得轉(zhuǎn)pTet-On、pTRE2-c-myc、pTRE2-SV40Tag基因小鼠。強(qiáng)力霉素持續(xù)給水誘導(dǎo)c-myc、SV40Tag表達(dá)，肉眼觀察到轉(zhuǎn)基因小鼠頭上出現(xiàn)“帽狀”腫脹；再通過(guò)核磁共振，掃描到在小腦和大腦交界處出現(xiàn)腫瘤，腹部也掃描到腫

13、瘤；剖檢發(fā)現(xiàn)確實(shí)在大腦和小腦之間有腫瘤，腹部胰腺也有瘤。我們一共誘導(dǎo)了17只轉(zhuǎn)pTet-On、pTRE2-c-myc、pTRE2-SV40Tag基因小鼠，有8只發(fā)瘤，發(fā)生率47％。誘導(dǎo)56-135d該轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)瘤。其中5只同時(shí)發(fā)胰腺瘤和腦瘤，2只單發(fā)腦瘤還有1只單發(fā)胰腺瘤(其編號(hào)分別為58、59、19、18、69、45、140、143＃)。同時(shí)我們也誘導(dǎo)了84只轉(zhuǎn)pTet-On、pTRE2-SV40Tag基因小鼠作為對(duì)照，只有3只發(fā)腦

14、瘤，發(fā)生率3.6％。 從誘導(dǎo)開(kāi)始到發(fā)瘤時(shí)間為150-220d。在同期的小鼠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中也用8只轉(zhuǎn)pTet-On、pTRE2-c-myc、pTRE2-SV40Tag基因小鼠未誘導(dǎo)做對(duì)照，沒(méi)有腫瘤發(fā)生。未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)pTet-On、pTRE2-SV40Tag基因小鼠10只也沒(méi)發(fā)瘤。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：誘導(dǎo)c-myc、SV40Tag表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠與誘導(dǎo)表達(dá)SV40Tag轉(zhuǎn)基因小鼠相比發(fā)瘤的幾率增大、發(fā)瘤的時(shí)間縮短、發(fā)瘤部位增多。結(jié)果提示c-m

15、yc和SV40Tag兩種基因的協(xié)同作用導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生部位增多、發(fā)生時(shí)間縮短、發(fā)生幾率增大，這也進(jìn)一步說(shuō)明c-myc基因在一定程度上可以加快或直接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。 本研究通過(guò)RT-PCR檢測(cè)了c-myc和SV40Tag基因表達(dá)的部位、以及它們?cè)谀X和胰腺表達(dá)時(shí)間，表明：c-myc基因不僅在腦和胰腺表達(dá)，在心、肝、脾、腎、胃、腸也表達(dá)；而SV40Tag除了在腦和胰腺表達(dá)外，在胸腺、心、肝、腎、胃中也表達(dá)。c-myc基因在腦部的小腦、

16、腦干中表達(dá)，而SV40Tag在腦部的皮層、小腦、腦干表達(dá)。c-myc和SV40Tag基因都是在DOX誘導(dǎo)第3d檢測(cè)到在腦和胰腺的表達(dá)。Real-timePCR結(jié)果顯示c-myc基因在腦腫瘤中表達(dá)量是誘導(dǎo)第3d表達(dá)量的64倍，c-myc基因在胰腺腫瘤中表達(dá)量是誘導(dǎo)第3d其在胰腺中表達(dá)量的74倍。SV40Tag基因在胰腺腫瘤中表達(dá)量是第3d胰腺中表達(dá)量的60倍。表明腫瘤發(fā)生與c-myc和SV40Tag高表達(dá)有直接的關(guān)系。 通過(guò)組織病

17、理學(xué)、細(xì)胞特異標(biāo)記分子的檢測(cè)等方法對(duì)轉(zhuǎn)pTet-On、pTRE2-c-myc、pTRE2-SV40Tag三基因小鼠腦腫瘤和胰腺腫瘤的類(lèi)型進(jìn)行初步鑒定。根據(jù)腦腫瘤病理切片的特征和Real-timePCR檢測(cè)到成神經(jīng)管細(xì)胞瘤起源的EGL祖細(xì)胞特異標(biāo)記分子math1在腦腫瘤中表達(dá)水平是正常小鼠表達(dá)水平的3倍；再結(jié)合膠質(zhì)細(xì)胞特異分子標(biāo)記GFAP、S100.β和神經(jīng)元的特異分子標(biāo)記NSE的免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)陽(yáng)性的結(jié)果，初步鑒定該腦腫瘤為小鼠成神