Tet-On系統(tǒng)誘導(dǎo)表達c-myc轉(zhuǎn)基因小鼠及腫瘤模型的建立.pdf

1、Tet-Off/Tet-On系統(tǒng)是一種利用原核調(diào)控元件在真核細胞中定量并特異地控制外源基因表達的體系，它是用大腸桿菌Tn10轉(zhuǎn)座子中四環(huán)素操縱子原理來實施調(diào)控的。Tet-Off/Tet-On系統(tǒng)是比較成熟的真核生物外源基因誘導(dǎo)表達系統(tǒng)之一，具有高效、無毒、開/關(guān)較嚴密等特點，已被成功地應(yīng)用于細胞和轉(zhuǎn)基因小鼠基因誘導(dǎo)表達的研究。c-myc是一種原癌基因，它是禽類骨髓瘤病毒v-myc的細胞同源序列，其編碼的蛋白是核內(nèi)特異性DNA結(jié)合蛋白。c

2、-myc加速了G1-S細胞周期進程，從而促進細胞增殖，形成腫瘤；還刺激細胞凋亡，c-myc是一個β細胞凋亡和嚙齒類動物體內(nèi)胰島分泌減少的強有力的引發(fā)者。 本研究首先應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，從人的宮頸癌細胞中成功擴增出預(yù)期大小為1.32Kb的c-myccDNA的特異性條帶。將擴增產(chǎn)物提純后克隆入pTZ57R/T載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選及酶切鑒定后，獲得了該基因的克隆pTZ57R/T-c-myc。測序后將c-myc基因亞克隆入Tet-On系

3、統(tǒng)的pTRE2載體中，獲得pTRE2-c-myc重組載體。為了便于轉(zhuǎn)基因細胞的篩選，我們將pCEP4上的Hyg酶切補平后克隆到同樣酶切補平的pTRE2-c-myc載體，獲得pTRE2-c-myc-Hyg。用pTet-On質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細胞，通過G418篩選獲得表達Tet-On系統(tǒng)調(diào)節(jié)元件rtTA的陽性細胞CHO-pTet-On，經(jīng)過有限稀釋法獲得16個轉(zhuǎn)pTet-On基因的細胞單克隆。RT-PCR檢測rtTA的表達后，將pTRE2-c-

4、myc-Hyg基因轉(zhuǎn)染能穩(wěn)定表達rtTA的單克隆細胞，潮霉素篩選獲得能誘導(dǎo)表達c-myc基因的CHO-pTet-On-pTRE2-c-myc-Hyg細胞，通過細胞亞克隆后得到轉(zhuǎn)pTet-On-pTRE2-c-myc-Hyg基因細胞的單克隆15個。強力霉素(DOX)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因細胞后，RT-PCR、間接免疫熒光檢測到c-myc的表達。WesternBlot檢測到c-myc基因的表達與誘導(dǎo)物濃度有一定的效量關(guān)系。這些結(jié)果表明我們建立的四環(huán)素誘

5、導(dǎo)表達體系是有效的，可以用于c-myc基因體外的研究。在正常的培養(yǎng)條件下，通過對轉(zhuǎn)pTet-On-pTRE2-c-myc-Hyg基因細胞生長測定，表明c-myc誘導(dǎo)表達的細胞生長增殖快，并在測定72h，差異顯著，表明c-myc促進細胞增殖。細胞周期測定表明c-myc基因的表達促進細胞由G1向S期過渡，從而促進細胞的增殖。但在低血清的條件下，轉(zhuǎn)pTet-On-pTRE2-c-myc-Hyg基因細胞通過流式細胞儀和TUNEL檢測到凋亡，表明

6、c-myc促進細胞凋亡。 在體外細胞上驗證Tet-On誘導(dǎo)c-myc基因表達系統(tǒng)可靠性的基礎(chǔ)上，我們利用pBC胰腺高表達啟動子的載體，構(gòu)建含有Tet-On系統(tǒng)調(diào)節(jié)元件中的rtTA的重組載體pBC-rtTA。通過高保真酶PCR擴增pTet-On上的rtTA基因，酶切rtTA，同時線形化pBC-SV40Tag載體(切去SV40Tag)，將rtTA克隆到pBC上獲得重組載體pBC-rtTA。將pBC-rtTA和pTRE2-c-myc經(jīng)

7、酶切線性化、純化后，顯微注射混合的雙基因到小鼠受精卵雄原核中。共注射603枚卵，將注射后存活263枚卵移植到21只受體母鼠的輸卵管中，17只母鼠懷孕，共產(chǎn)仔59只。PCR檢測得到3只founder轉(zhuǎn)基因鼠，其中轉(zhuǎn)pBC-rtTA、pTRE2-c-myc基因陽性的公鼠2只(編號為6＃和14＃)，同時獲得轉(zhuǎn)pTRE2-c-myc單基因陽性公鼠1只(編號為32＃)。SouthernBlot檢測證實了PCR檢測的結(jié)果。3只founder小鼠與正

8、常FVB配種，仔代經(jīng)PCR檢測，統(tǒng)計結(jié)果符合孟德爾遺傳定律，證明外源基因穩(wěn)定遺傳給后代。轉(zhuǎn)pBC-rtTA、pTRE2-c-myc雙基因陽性小鼠仔代經(jīng)DOX誘導(dǎo)后，RT-PCR檢測到1只founder的后代在其腦、心、肝、脾、腎、胃、腸、胰腺、生殖器部位表達c-myc基因。另1只founder的后代檢測不到c-myc基因的表達。我們獲得能誘導(dǎo)表達c-myc的轉(zhuǎn)pBC-rtTA、pTRE2-c-myc基因小鼠。 將轉(zhuǎn)pBC-rtT

9、A、pTRE2-c-myc基因陽性且能表達c-myc的轉(zhuǎn)基因小鼠擴大繁殖。通過對轉(zhuǎn)pBC-rtTA、pTRE2-c-myc基因小鼠形態(tài)、行為的觀察，和對轉(zhuǎn)基因小鼠生長發(fā)育、繁殖指標(biāo)、血液生理生化等指標(biāo)測定和淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗以及組織切片的病理分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn)pBC-rtTA、pTRE2-c-myc基因小鼠經(jīng)DOX誘導(dǎo)后，與正常的小鼠以及未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)雙基因小鼠相比，其形態(tài)和行為，肉眼觀察未見異常；生長發(fā)育方面：體重要顯著低于正常的FVB小鼠和

10、出生后未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠；同時在腸道長度的比較方面得到DOX誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠的大腸和小腸的長度略低于正常小鼠和轉(zhuǎn)基因未誘導(dǎo)的小鼠；其它臟器和繁殖指標(biāo)測定結(jié)果差異不顯著；淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗顯示DOX誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)pBC-rtTA、pTRE2-c-myc基因小鼠指標(biāo)高于正常小鼠和不誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠但差異不顯著；血液生物化學(xué)指標(biāo)和血液生理指標(biāo)差異也不顯著；組織切片病理分析，轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)后與正常小鼠和未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠相比腎出現(xiàn)病變，腎小管上皮細胞腫脹、

11、腎小管腔狹窄，腎小球腎炎。 我們用胰腺高表達的啟動子啟動rtTA表達，再用其調(diào)控c-myc在轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達，經(jīng)過一段時間的誘導(dǎo)，RT-PCR在胰腺、腎、脾、肝等臟器上檢測到了c-myc基因的表達，出現(xiàn)生長發(fā)育較慢?？赡苡捎赾-myc促細胞凋亡產(chǎn)生的影響。考慮到c-myc雙向功能，我們用另一個促細胞增殖的因子刺激c-myc以使其發(fā)揮促細胞增殖的作用，來建立腫瘤模型。本實驗室已建立了pTet-On、pTRE2-SV40Tag轉(zhuǎn)基

12、因小鼠。SimianVirus40(SV40)屬于多瘤病毒屬，SV40Tag具有致瘤性。我們利用制作的轉(zhuǎn)pTRE2-c-myc單基因陽性小鼠與pTet-On、pTRE2-SV40Tag轉(zhuǎn)基因小鼠配種，獲得轉(zhuǎn)pTet-On、pTRE2-c-myc、pTRE2-SV40Tag基因小鼠。強力霉素持續(xù)給水誘導(dǎo)c-myc、SV40Tag表達，肉眼觀察到轉(zhuǎn)基因小鼠頭上出現(xiàn)“帽狀”腫脹；再通過核磁共振，掃描到在小腦和大腦交界處出現(xiàn)腫瘤，腹部也掃描到腫

13、瘤；剖檢發(fā)現(xiàn)確實在大腦和小腦之間有腫瘤，腹部胰腺也有瘤。我們一共誘導(dǎo)了17只轉(zhuǎn)pTet-On、pTRE2-c-myc、pTRE2-SV40Tag基因小鼠，有8只發(fā)瘤，發(fā)生率47％。誘導(dǎo)56-135d該轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)瘤。其中5只同時發(fā)胰腺瘤和腦瘤，2只單發(fā)腦瘤還有1只單發(fā)胰腺瘤(其編號分別為58、59、19、18、69、45、140、143＃)。同時我們也誘導(dǎo)了84只轉(zhuǎn)pTet-On、pTRE2-SV40Tag基因小鼠作為對照，只有3只發(fā)腦

14、瘤，發(fā)生率3.6％。 從誘導(dǎo)開始到發(fā)瘤時間為150-220d。在同期的小鼠誘導(dǎo)實驗中也用8只轉(zhuǎn)pTet-On、pTRE2-c-myc、pTRE2-SV40Tag基因小鼠未誘導(dǎo)做對照，沒有腫瘤發(fā)生。未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)pTet-On、pTRE2-SV40Tag基因小鼠10只也沒發(fā)瘤。此實驗結(jié)果表明：誘導(dǎo)c-myc、SV40Tag表達的轉(zhuǎn)基因小鼠與誘導(dǎo)表達SV40Tag轉(zhuǎn)基因小鼠相比發(fā)瘤的幾率增大、發(fā)瘤的時間縮短、發(fā)瘤部位增多。結(jié)果提示c-m

15、yc和SV40Tag兩種基因的協(xié)同作用導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生部位增多、發(fā)生時間縮短、發(fā)生幾率增大，這也進一步說明c-myc基因在一定程度上可以加快或直接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。 本研究通過RT-PCR檢測了c-myc和SV40Tag基因表達的部位、以及它們在腦和胰腺表達時間，表明：c-myc基因不僅在腦和胰腺表達，在心、肝、脾、腎、胃、腸也表達；而SV40Tag除了在腦和胰腺表達外，在胸腺、心、肝、腎、胃中也表達。c-myc基因在腦部的小腦、

16、腦干中表達，而SV40Tag在腦部的皮層、小腦、腦干表達。c-myc和SV40Tag基因都是在DOX誘導(dǎo)第3d檢測到在腦和胰腺的表達。Real-timePCR結(jié)果顯示c-myc基因在腦腫瘤中表達量是誘導(dǎo)第3d表達量的64倍，c-myc基因在胰腺腫瘤中表達量是誘導(dǎo)第3d其在胰腺中表達量的74倍。SV40Tag基因在胰腺腫瘤中表達量是第3d胰腺中表達量的60倍。表明腫瘤發(fā)生與c-myc和SV40Tag高表達有直接的關(guān)系。 通過組織病

17、理學(xué)、細胞特異標(biāo)記分子的檢測等方法對轉(zhuǎn)pTet-On、pTRE2-c-myc、pTRE2-SV40Tag三基因小鼠腦腫瘤和胰腺腫瘤的類型進行初步鑒定。根據(jù)腦腫瘤病理切片的特征和Real-timePCR檢測到成神經(jīng)管細胞瘤起源的EGL祖細胞特異標(biāo)記分子math1在腦腫瘤中表達水平是正常小鼠表達水平的3倍；再結(jié)合膠質(zhì)細胞特異分子標(biāo)記GFAP、S100.β和神經(jīng)元的特異分子標(biāo)記NSE的免疫組織化學(xué)方法檢測陽性的結(jié)果，初步鑒定該腦腫瘤為小鼠成神