Tet-On誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及TROP2生物學(xué)功能的研究.pdf

1、研究目的:
　　通過(guò)在293細(xì)胞中建立Tet-On誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，檢測(cè)該系統(tǒng)是否能誘導(dǎo)TROP2蛋白的表達(dá)，并探討TROP2蛋白在促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移與侵襲功能方面的作用。
　　研究方法:
　　1.Tet-On-Advanced穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建
　　用Tet-On-Advanced質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過(guò)G418篩選，RT-PCR法檢測(cè)四環(huán)素反應(yīng)轉(zhuǎn)錄活化因子(rtTA)基因，篩選轉(zhuǎn)染陽(yáng)性克隆。通過(guò)pTRE-Tig

2、ht-Luc載體轉(zhuǎn)染上述陽(yáng)性轉(zhuǎn)染克隆，經(jīng)強(qiáng)力霉素(DOX)誘導(dǎo)熒光素酶表達(dá)，用螢火蟲(chóng)熒光素酶試劑盒檢測(cè)，驗(yàn)證Tet-On系統(tǒng)，篩出穩(wěn)定細(xì)胞株。
　　2.DOX調(diào)節(jié)293細(xì)胞中TROP2蛋白的表達(dá)
　　構(gòu)建含TROP2基因的重組載體pTRE-Tight-TROP2:采用PCR擴(kuò)增TROP2基因，提取pTRE-Tight質(zhì)粒，EcoRⅠ與XbaⅠ雙酶切TROP2基因與pTRE-Tight質(zhì)粒，T4連接酶連接酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化感受態(tài)D

3、H5α，挑單克隆菌株搖菌，將菌液做模板，擴(kuò)增TROP2基因，取陽(yáng)性株提取重組質(zhì)粒，送公司測(cè)序。
　　將pTRE-Tight-TROP2轉(zhuǎn)染進(jìn)Tet-On-Advanced穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，設(shè)立不同實(shí)驗(yàn)組:Ⅰ組:不轉(zhuǎn)染pTRE-Tight-TROP2質(zhì)粒組;Ⅱ組:轉(zhuǎn)染pTRE-Tight-TROP2質(zhì)粒且加DOX(1000ng/ml)組;Ⅲ組:轉(zhuǎn)染pTRE-Tight-TROP2質(zhì)粒且不加DOX組。RT-PCR檢測(cè)不同組細(xì)胞的TROP2基

4、因，F(xiàn)CM檢測(cè)不同組細(xì)胞的TROP2蛋白表達(dá)。
　　3.TROP2蛋白對(duì)細(xì)胞增殖、遷移與侵襲功能的作用
　　通過(guò)增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)與Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TROP2蛋白功能。
　　研究結(jié)果:
　　1.Tet-On-Advanced穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建
　　Tet-On-Advanced質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，經(jīng)過(guò)G418篩選和亞克隆，獲得21株單克隆細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)。RT-PCR

5、檢測(cè)21株單克隆細(xì)胞株中四環(huán)素反應(yīng)轉(zhuǎn)錄活化因子(rtTA)基因，結(jié)果顯示，21株單克隆株中，有10株檢測(cè)到rtTA基因，編號(hào)為1-10。從10株細(xì)胞株中，用螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)試劑盒挑選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，結(jié)果顯示，加DOX組的熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果明顯高于不加DOX組，從中選出熒光度值高于3000的4株細(xì)胞（1、2、6、9、號(hào)細(xì)胞株）為候選細(xì)胞。考慮到本底的因素，1號(hào)細(xì)胞株被選出做為轉(zhuǎn)染效果最好的細(xì)胞株，用于后續(xù)試驗(yàn)。
　　2.DOX調(diào)

6、節(jié)293細(xì)胞中TROP2蛋白的表達(dá)
　　PCR法擴(kuò)增TROP2基因，結(jié)果顯示有大小為969bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。TROP2基因與pTRE-Tight載體經(jīng)雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌、涂板，挑10個(gè)單克隆菌落進(jìn)行搖菌，將菌液做模板，擴(kuò)增TROP2基因，得2株陽(yáng)性菌株。提取質(zhì)粒，電泳顯示大小均為3574bp，與預(yù)期結(jié)果一致。核酸序列分析結(jié)果證明其序列正確，表明所得質(zhì)粒為重組質(zhì)粒pTRE-Tight-TROP2。

7、　　pTRE-Tight-TROP2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Tet-On-Advanced穩(wěn)定細(xì)胞株，經(jīng)DOX誘導(dǎo)，RT-PCR法檢測(cè)3組細(xì)胞中TROP2基因的表達(dá)水平，F(xiàn)CM法檢測(cè)3組細(xì)胞中TROP2蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，加DOX組細(xì)胞中TROP2基因、蛋白的水平明顯高于對(duì)照組。
　　3.TROP2蛋白對(duì)細(xì)胞增殖、遷移與侵襲功能的作用
　　MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖情況，結(jié)果顯示，加DOX組細(xì)胞增殖速度明顯比對(duì)照組細(xì)胞快;劃痕實(shí)驗(yàn)

8、與Transwell遷移實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)細(xì)胞遷移功能，拍照記錄、MTT檢測(cè)與結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，加DOX組細(xì)胞遷移能力明顯高于對(duì)照組;Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲功能，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)及結(jié)晶紫染色，結(jié)果表明，相對(duì)于對(duì)照組，加DOX組細(xì)胞的侵襲功能明顯升高。
　　研究結(jié)論:
　　在293細(xì)胞中成功構(gòu)建了穩(wěn)定的Tet-On誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，且誘導(dǎo)表達(dá)效果較為顯著。構(gòu)建重組質(zhì)粒pTRE-Tight-TROP2，將其轉(zhuǎn)染制各好的Tet