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文檔簡介
1、研究目的:
通過在293細胞中建立Tet-On誘導基因表達系統(tǒng),檢測該系統(tǒng)是否能誘導TROP2蛋白的表達,并探討TROP2蛋白在促進細胞增殖、遷移與侵襲功能方面的作用。
研究方法:
1.Tet-On-Advanced穩(wěn)定細胞株的構建
用Tet-On-Advanced質粒轉染293細胞,通過G418篩選,RT-PCR法檢測四環(huán)素反應轉錄活化因子(rtTA)基因,篩選轉染陽性克隆。通過pTRE-Tig
2、ht-Luc載體轉染上述陽性轉染克隆,經強力霉素(DOX)誘導熒光素酶表達,用螢火蟲熒光素酶試劑盒檢測,驗證Tet-On系統(tǒng),篩出穩(wěn)定細胞株。
2.DOX調節(jié)293細胞中TROP2蛋白的表達
構建含TROP2基因的重組載體pTRE-Tight-TROP2:采用PCR擴增TROP2基因,提取pTRE-Tight質粒,EcoRⅠ與XbaⅠ雙酶切TROP2基因與pTRE-Tight質粒,T4連接酶連接酶切產物,轉化感受態(tài)D
3、H5α,挑單克隆菌株搖菌,將菌液做模板,擴增TROP2基因,取陽性株提取重組質粒,送公司測序。
將pTRE-Tight-TROP2轉染進Tet-On-Advanced穩(wěn)定轉染株,設立不同實驗組:Ⅰ組:不轉染pTRE-Tight-TROP2質粒組;Ⅱ組:轉染pTRE-Tight-TROP2質粒且加DOX(1000ng/ml)組;Ⅲ組:轉染pTRE-Tight-TROP2質粒且不加DOX組。RT-PCR檢測不同組細胞的TROP2基
4、因,F(xiàn)CM檢測不同組細胞的TROP2蛋白表達。
3.TROP2蛋白對細胞增殖、遷移與侵襲功能的作用
通過增殖實驗、劃痕實驗、Transwell遷移實驗與Transwell侵襲實驗檢測TROP2蛋白功能。
研究結果:
1.Tet-On-Advanced穩(wěn)定細胞株的構建
Tet-On-Advanced質粒轉染293細胞,經過G418篩選和亞克隆,獲得21株單克隆細胞株,擴大培養(yǎng)。RT-PCR
5、檢測21株單克隆細胞株中四環(huán)素反應轉錄活化因子(rtTA)基因,結果顯示,21株單克隆株中,有10株檢測到rtTA基因,編號為1-10。從10株細胞株中,用螢火蟲熒光素酶檢測試劑盒挑選穩(wěn)定轉染細胞株,結果顯示,加DOX組的熒光素酶活性檢測結果明顯高于不加DOX組,從中選出熒光度值高于3000的4株細胞(1、2、6、9、號細胞株)為候選細胞??紤]到本底的因素,1號細胞株被選出做為轉染效果最好的細胞株,用于后續(xù)試驗。
2.DOX調
6、節(jié)293細胞中TROP2蛋白的表達
PCR法擴增TROP2基因,結果顯示有大小為969bp的條帶,與預期結果相符。TROP2基因與pTRE-Tight載體經雙酶切、連接、轉化DH5α感受態(tài)細菌、涂板,挑10個單克隆菌落進行搖菌,將菌液做模板,擴增TROP2基因,得2株陽性菌株。提取質粒,電泳顯示大小均為3574bp,與預期結果一致。核酸序列分析結果證明其序列正確,表明所得質粒為重組質粒pTRE-Tight-TROP2。
7、 pTRE-Tight-TROP2重組質粒轉染Tet-On-Advanced穩(wěn)定細胞株,經DOX誘導,RT-PCR法檢測3組細胞中TROP2基因的表達水平,F(xiàn)CM法檢測3組細胞中TROP2蛋白的表達水平。結果顯示,加DOX組細胞中TROP2基因、蛋白的水平明顯高于對照組。
3.TROP2蛋白對細胞增殖、遷移與侵襲功能的作用
MTT法檢測細胞生長、增殖情況,結果顯示,加DOX組細胞增殖速度明顯比對照組細胞快;劃痕實驗
8、與Transwell遷移實驗用于檢測細胞遷移功能,拍照記錄、MTT檢測與結晶紫染色結果顯示,加DOX組細胞遷移能力明顯高于對照組;Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲功能,通過細胞計數(shù)及結晶紫染色,結果表明,相對于對照組,加DOX組細胞的侵襲功能明顯升高。
研究結論:
在293細胞中成功構建了穩(wěn)定的Tet-On誘導表達系統(tǒng),且誘導表達效果較為顯著。構建重組質粒pTRE-Tight-TROP2,將其轉染制各好的Tet
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