青錢柳多糖的分子修飾及其生物活性研究.pdf

1、青錢柳[Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinskaja]系胡桃科青錢柳屬，是我國特有的單種屬喬木植物，目前已知其樹葉具有抗氧化、抗凝血、免疫調(diào)節(jié)等生理功能。隨著糖生物學(xué)研究的深入，包括硫酸化、羥甲基化、磷酸化等在內(nèi)的分子修飾在多糖的研究中逐步成為熱點(diǎn)內(nèi)容之一。其中，硫酸化多糖由于其良好的抗氧化、抗病毒等活性，受到科研工作者的廣泛關(guān)注。本文以江西修水青錢柳為原料，綜合應(yīng)用食品科學(xué)、有機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)及現(xiàn)代儀器分

2、析等技術(shù)與方法，對(duì)青錢柳多糖的提取精制、化學(xué)修飾、修飾產(chǎn)物的抗氧化性進(jìn)行了研究，為豐富青錢柳多糖的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下：
　　1.建立了基于苯酚－硫酸比色分析技術(shù)的青錢柳多糖含量的快速檢測(cè)方法及基于微波消解聯(lián)合 ICP-AES法分析青錢柳多糖無機(jī)元素的方法。青錢柳用水提取，經(jīng)多級(jí)處理除去脂類、單糖、雙糖、低聚糖、氨基酸、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)制得青錢柳精制多糖，采用精制多糖測(cè)得青錢柳多糖對(duì)葡萄糖的換算因子，建立了基

3、于苯酚-硫酸法定量分析青錢柳多糖含量。結(jié)果表明，該方法快速、顯色穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、平均回收率為98.20％，RSD為2.50%，適用于青錢柳多糖的含量測(cè)定，測(cè)得青錢柳多糖的平均含量為4.47%。采用微波消解聯(lián)合 ICP-AES法測(cè)定了青錢柳多糖中無機(jī)元素含量，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、檢測(cè)限為0.01-3.80 mg/kg，平均回收率為94.3%～105.69%，RSD為1.01%～4.23%。樣品中Na, Ca, Al, Mg,

4、 K, Fe, P, Zn, Mn, Cr, As, Cu, Pb和 Se的平均含量分別為137.1±4.2,5980.0±102.7,885.3±25.6,1126.6±42.2,1810.5±30.5,633.0±21.8,2359.1±69.7,31.2±0.3,274.5±10.3,1.7±0.1,7.9±0.1,0.9±0.112.7±0.4,和17.7±0.2 mg/kg，且Ca、Fe、Mg含量較高。在測(cè)定的18種元素中，青

5、錢柳多糖由于Ni、Cd、V和Co等4種元素的含量低于檢測(cè)限，而未能檢出。
　　2.采用氯磺酸—吡啶法、乙酸酐法以及氫氧化鈉-氯乙酸反應(yīng)體系分別成功對(duì)青錢柳多糖進(jìn)行硫酸化、乙酰化和羧甲基化修飾。青錢柳多糖使用熱水浸提法自行提取，經(jīng)過脫蛋白后得到青錢柳精制多糖。分別使用氯磺酸吡啶體積比為1:1,1:4,1:6,1:8制得四種不同取代度的硫酸化青錢柳多糖，分別命名為S-CP1-1，S-CP1-4，S-CP1-6和S-CP1-8。通過控制

6、乙酸酐劑量，以乙酸酐法制得的青錢柳多糖乙酰化產(chǎn)物分別記為 Ac-CP1、Ac-CP2和Ac-CP3；以及氯乙酸的量，分別在以制得的青錢柳多糖羧甲基產(chǎn)物 CM-CP1、CM-CP2和 CM-CP3。通過各種方法分析了其蛋白質(zhì)、糖醛酸、取代度、分子量、單糖組成等理化性質(zhì)，利用HPAEC-PAD離子色譜分析技術(shù)對(duì)青錢柳硫酸化多糖S-CP1-1，S-CP1-4，S-CP1-6和S-CP1-8，Ac-CP1、Ac-CP2和Ac-CP3，CM-CP

7、1、CM-CP2和CM-CP3單糖組成進(jìn)行分析，結(jié)果表明各修飾產(chǎn)物多糖單糖主要為阿拉伯糖，半乳糖，葡萄糖以及半乳糖醛酸。通過紅外光譜、紫外光譜、圓二光譜等探索硫酸化、乙?；汪燃谆揎棇?duì)青錢柳多糖結(jié)構(gòu)的影響，采用紫外光譜190-400 nm范圍內(nèi)對(duì)修飾前后的青錢柳多糖進(jìn)行掃描，未出現(xiàn)新的特征吸收，F(xiàn)TIR圖譜顯示這四種青錢柳多糖衍生物中均有相應(yīng)的修飾基團(tuán)，表明硫酸化、乙酰化和羧甲基化修飾都獲得成功。
　　3.構(gòu)建DPPH自由基體

8、系，超氧陰離子自由基、Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基及胡蘿卜素/亞油酸體系等抗氧化體系，探索硫酸化修飾產(chǎn)物（S-CP1-1，S-CP1-4， S-CP1-6和S-CP1-8）、乙酰化修飾產(chǎn)物（Ac-CP1、Ac-CP2和Ac-CP3）和羧甲基化修飾產(chǎn)物（CM-CP1、CM-CP2和CM-CP3）的抗氧化性，并與未經(jīng)修飾的青錢柳多糖抗氧化性進(jìn)行比較。青錢柳硫酸化多糖S-CP1-1，S-CP1-4，S-CP1-6和S-CP1-8對(duì) DPPH

9、自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基等均有一定的清除作用。硫酸化后，同一濃度 S-CP1-8和 S-CP1-6對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基清除率高于青錢柳多糖，而S-CP1-1和S-CP1-4的清除率卻低于青錢柳多糖，并且在其它抗氧化體系中也表現(xiàn)出不同的取代度的硫酸化修飾的自由基清除活性產(chǎn)生的效應(yīng)存在很大的差異，并且與各抗氧化測(cè)試體系也有相關(guān)性。對(duì)青錢柳多糖進(jìn)行適度硫酸酯化修飾可以顯著增強(qiáng)該多糖對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基和DPP

10、H自由基的清除活性，過度硫酸酯化會(huì)造成該多糖對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基和 DPPH自由基的清除活性降低。表明對(duì)青錢柳多糖進(jìn)行適度的硫酸化修飾才能使其抗氧化性得到顯著提高。羧甲基化基團(tuán)的引入影響了多糖的水溶性，羧甲基化修飾產(chǎn)物 CM-CP1、CM-CP2和 CM-CP3）的抗氧化性均低于原多糖。各硫酸化、乙?；棒燃谆揎棶a(chǎn)物的抗氧化性均低于Vc。這些證明了化學(xué)基團(tuán)的引入可能會(huì)增強(qiáng)多糖的活性、改變了多糖的生物活性。同時(shí)研究結(jié)果表明多糖

11、的抗氧化活性和它的結(jié)構(gòu)參數(shù)如取代度、分子量、其他取代基團(tuán)的種類和位置等有關(guān)。由于青錢柳多糖的結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜，分子修飾后的多糖的理化特性、結(jié)構(gòu)等也存在較大差異，而使多糖的抗氧化所產(chǎn)生的效果也各不相同。
　　4.以小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞為研究對(duì)象，探討了青錢柳多糖及其修飾后產(chǎn)物對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青錢柳多糖及其修飾后產(chǎn)物均能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖，無細(xì)胞毒性；增強(qiáng)細(xì)胞吞噬功能；上調(diào)活性氧NO及細(xì)胞因子腫瘤壞死因子