化學(xué)修飾siRNA的設(shè)計、合成及其生物活性研究.pdf

1、siRNA（ShortinterferingRNA，siRNA）干擾技術(shù)作為一種新型的基因沉默技術(shù)，因其具有高效、高特異性、低毒性等優(yōu)點，應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)開發(fā)新型的靶向藥物，已成為藥物研究領(lǐng)域中重點發(fā)展方向之一。近年來，已經(jīng)證實Argonaute蛋白（Ago蛋白）是RNA誘導(dǎo)基因沉默復(fù)合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)中關(guān)鍵的調(diào)控蛋白之一，在RNA干擾途徑中，參與siRNA的識別、解鏈以及催化

2、切割mRNA等功能，對靶基因沉默作用起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。本論文是針對Ago蛋白與siRNA分子的協(xié)同作用機制，基于Ago蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，采用計算機輔助設(shè)計、熒光素酶活性篩選等研究方法，系統(tǒng)地研究化學(xué)修飾位點、修飾單體以及修飾組合與生物活性之間的關(guān)系，由此篩選出具有顯著基因沉默作用的siRNA化學(xué)修飾組合，并且應(yīng)用該修飾技術(shù)，利用前期研究已發(fā)現(xiàn)的高特異沉默作用的MDM2-siRNA序列，對化學(xué)修飾MDM2-siRNA進行了體外生物活性篩選。由

3、此初步建立新型的siRNA化學(xué)修飾技術(shù)，并同時獲得高特異性、高活性、高穩(wěn)定性的化學(xué)修飾的MDM2-siRNA。
　　 一、FANA化學(xué)修飾位點與生物活性的研究
　　 針對Ago蛋白與siRNA協(xié)同引起基因沉默作用的特點，選擇特異性抑制病毒生長的5種不同靶基因siRNA序列，利用2'-脫氧-2'-氟-b-D-阿拉伯糖核苷酸(2'-Deoxy-2'-fluoro-b-D-arabinonucleicacid，F(xiàn)ANA)修飾不

4、改變RNA螺旋構(gòu)型的技術(shù)優(yōu)點，以該結(jié)構(gòu)作為小分子探針，研究siRNA堿基序列不同化學(xué)修飾位點與生物活性之間的關(guān)系。生物活性檢測結(jié)果顯示：
　　 1．siRNA正義鏈、反義鏈3'末端堿基FANA修飾，均能不同程度的降低靶基因沉默作用，其中反義鏈降低的作用更為顯著。
　　 2．反義鏈3'末端以及中間位點的堿基修飾，均容易導(dǎo)致化學(xué)修飾siRNA活性降低，尤其反義鏈中間9～11位堿基的修飾，生物活性作用降低更為顯著。
　　

5、 3．正義鏈FANA修飾對基因沉默作用的影響相對較弱，正義鏈中間位點不同區(qū)域片段的堿基修飾，均能在不同程度上影響siRNA的活性，一般修飾后活性強弱順序如下：D區(qū)＞C區(qū)＞B區(qū)，其中D區(qū)堿基修飾可能會在一定程度上提高基因沉默作用。
　　 在本研究中，我們完成了FANA修飾單體的合成工藝探索，同時針對5種不同的靶序列，完成了44個新型化學(xué)修飾siRNA的制備，其中Ⅱ-siRNA6、Ⅱ-siRNA11以及V-siRNA3對病毒的抑制

6、作用顯著，值得進一步評價。
　　 二、Ago蛋白PAZ區(qū)的理論研究
　　 基于Ago蛋白PAZ區(qū)的晶體結(jié)構(gòu)，設(shè)計了X、Y和Z共3種系列的新型化學(xué)修飾單體，利用計算機輔助藥物設(shè)計的方法，預(yù)測了PAZ區(qū)與3'末端不同化學(xué)修飾組合相互之間的結(jié)合能，初步推測其與基因沉默作用之間的關(guān)系，實驗結(jié)果顯示：
　　 1．選擇1SI2和1SI3的晶體蛋白進行骨架疊合，二者疊合結(jié)果十分理想，PAZ區(qū)的結(jié)構(gòu)相對比較保守；以1SI2作為模

7、板，對siRNA與Ago蛋白的作用模式進行結(jié)構(gòu)分析，數(shù)據(jù)表明siRNA的3'末端堿基可以與PAZ口袋區(qū)特異結(jié)合，適當(dāng)引入疏水性基團，有利于兩者之間的相互作用。
　　 2．選擇X、Z系列的修飾單體，利用MacroModel模塊，預(yù)測和評價了3'末端不同化學(xué)修飾組合與Ago蛋白PAZ口袋區(qū)結(jié)合能量變化的趨勢，結(jié)果顯示，dTX修飾組合總結(jié)合能、范德華作用力結(jié)合能均最小。
　　 3．利用計算機輔助設(shè)計中分子疊合的方法，初步預(yù)測和

8、評價了3'末端不同的修飾組合與Ago蛋白PAZ口袋區(qū)結(jié)合后立體構(gòu)型的變化狀態(tài)，實驗結(jié)果表明，相對于未修飾dTdT組合，dTX修飾組合立體構(gòu)型基本保持不變，第2位疏水性基團替代嘧啶類結(jié)構(gòu)，有助于芳香性疏水片段與PAZ區(qū)疏水性氨基酸殘基，通過弱的范德華作用產(chǎn)生靜電結(jié)合。
　　 4．新型修飾單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)，活性結(jié)合位點取代基團的電負(fù)性，以及結(jié)合作用模式等，均影響總結(jié)合能的變化，引入疏水片段能顯著降低總結(jié)合能；dTX修飾組合在空間結(jié)構(gòu)上

9、與dTdT組合基本保持一致，芳香性疏水片段替代堿基更有助于降低siRNA的3'末端與PAZ區(qū)的結(jié)合能；推測dTX修飾組合將極有可能起到增強基因沉默作用的效果。
　　 三、末端修飾siRNA的研究
　　 設(shè)計并合成了X、Y和Z共3種系列的新型化學(xué)修飾單體?；跓晒馑孛阜€(wěn)定表達的HepG2/PGL4細(xì)胞，選擇X系列的修飾單體，采用雙熒光素酶的篩選方法，對化學(xué)修飾的siRNA進行了體外生物活性的篩選，實驗結(jié)果顯示：
　　

10、 1．相對于未修飾siRNA，化學(xué)修飾siRNA在500nM給藥劑量下，未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，表現(xiàn)出比未修飾siRNA更低的細(xì)胞毒性。
　　 2．dTX修飾的反義鏈與不同修飾的正義鏈交叉組合，制備獲得新型化學(xué)修飾siRNAs，均能明顯增強對靶基因的沉默作用。
　　 3.3'端siRNA的化學(xué)修飾，能顯著改變siRNA的基因沉默作用，說明PAZ區(qū)與siRNA的特異識別，在基因沉默作用中可能起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用,3'末端的堿基

11、是siRNA關(guān)鍵的修飾位點。
　　 4．通過生物活性的篩選，初步發(fā)現(xiàn)修飾組合為XdT/dTX、dTX/dTX（正義鏈／反義鏈），能顯著增強siRNA的基因沉默作用。
　　 四、化學(xué)修飾MDM2-siRNA的研究
　　 采用具有顯著增強基因沉默作用的化學(xué)修飾組合，完成了不同化學(xué)修飾MDM2-siRNA的設(shè)計、合成以及生物活性、生物穩(wěn)定性的研究，實驗結(jié)果顯示：
　　 1．前期篩選獲得的XdT/dTX、dTX/

12、dTX、以及dTX/XX等化學(xué)修飾組合，能顯著增強siRNA對腫瘤細(xì)胞MDM2的基因沉默作用。
　　 2．不同化學(xué)修飾組合的siRNA與未修飾siRNA相比，能不同程度地提高siRNA的穩(wěn)定性，其中dTX/dTX修飾組合穩(wěn)定性優(yōu)于其他修飾組合。
　　 3．篩選獲得的Ⅶ-siRNA6相對未修飾siRNA，能明顯提高基因沉默作用、穩(wěn)定性、以及體外抗腫瘤活性，其活性作用分別提高約為2、2和3倍左右，Ⅶ-siRNA6可以作為較好

13、的候選化合物，進行更深入的篩選和評價研究。
　　 以上實驗結(jié)果表明：反義鏈C區(qū)、正義鏈B區(qū)的堿基與Ago蛋白協(xié)同作用，參與siRNA的解鏈和切割的過程，這些位點FANA修飾，容易阻礙Ago蛋白對siRNA的催化解鏈功能，從而顯著降低修飾后siRNA的基因沉默作用；3'末端引入不同的化學(xué)修飾基團，能顯著影響siRNA與Ago蛋白結(jié)合和解離的能力，反義鏈3'末端化學(xué)修飾單體或修飾組合的改變，對基因沉默作用的保留或提高起關(guān)鍵作用。

14、r>　　 基于siRNA的3'末端與Ago蛋白特異結(jié)合的分子作用機制，通過Ago蛋白的理論研究和生物活性篩選的研究，初步證實理論計算的結(jié)合能與生物活性存在一定的聯(lián)系，利用結(jié)合能、結(jié)合模式的評估，可以在總體趨勢上較好的預(yù)測修飾組合與生物活性之間潛在的規(guī)律；此外，應(yīng)用理論計算結(jié)果虛擬篩選獲得的幾種修飾組合，在不同靶序列的篩選上均能顯著提高基因沉默作用，該修飾組合技術(shù)具有一定的通用性；dTX/dTX化學(xué)修飾組合，能顯著提高MDM2-siRN