Ⅱ組冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白1內(nèi)保守序列LLRKXGXKG的功能研究.pdf

1、冠狀病毒可引起人和動(dòng)物的多種疾病，其中人類冠狀病毒可引起10％-30%的普通感冒，亦可引起如SAPS等嚴(yán)重傳染病。我國(guó)是冠狀病毒的主要分布地之一，因此開展冠狀病毒致病機(jī)制的研究對(duì)于提高我國(guó)應(yīng)對(duì)此類疾病的防控能力具有重要意義。
　　 但目前出于生物安全方面的考慮，針對(duì)SARS-CoV致病機(jī)制的研究受到了嚴(yán)重的制約。在這種情況下，與SARS親緣關(guān)系較近的鼠肝炎冠狀病毒(Mouse Hepatitis Virus，MHV)便成為較為理

2、想的研究對(duì)象。這是因?yàn)椋旱谝唬蟾窝坠跔畈《?Mouse Hepatitis Virus，MHV)與SARS冠狀病毒（SARS-CoV）同屬于Ⅱ組冠狀病毒，兩者的親緣關(guān)系較近；第二，MHV是Ⅱ組冠狀病毒的代表株，它具有良好的動(dòng)物模型；第三，MHV對(duì)人不致病，易于開展實(shí)驗(yàn)研究，其研究成果對(duì)人類疾病也更具有指導(dǎo)意義。
　　 研究表明，MHV和SARS-CoV的非結(jié)構(gòu)蛋白l(Non-Structural Protein1．NSPl)具

3、有抑制宿主抗病毒反應(yīng)的功能，是冠狀病毒的重要致病因子。并且通過配對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，在MHV和SARS-CoV NSPl中存在著一段高度保守的氨基酸序列-LLRKxGxKG。該序列可能是NSPI的重要功能域，與MHV NSPI和SARS-CoV NSP1共同具有的某些功能有關(guān)。這值得我們進(jìn)行深入的研究。
　　 因此，本研究以MHV為研究模式株，從Ⅱ組冠狀病毒MHV與SARS-CoV NSP1內(nèi)高度保守的氨基酸序列-LLRKxGxKG入手

4、，對(duì)該保守序列進(jìn)行缺失突變，分別構(gòu)建了MHV NSPI突變基因及MHV突變體。通過檢測(cè)LLRKxGxKG序列缺失前后NSPI蛋白的功能變化，并分析MHV突變體的復(fù)制能力，以及對(duì)小鼠的致病力和組織嗜性等方面的變化，從分子、細(xì)胞和動(dòng)物三級(jí)水平上揭示II組冠狀病毒NSPI及其保守序列LLRKxGxKG的功能。以期加深我們對(duì)SARS-CoV等Ⅱ組冠狀病毒致病機(jī)制的了解，并為抗病毒藥物的設(shè)計(jì)和新型減毒疫苗的研制提供參考。一、鼠肝炎冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋

5、白1及其保守序列LLRKxGxKG的體外功能研究
　　 首先，我們分別構(gòu)建了MHV NSPI的真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-NSPl)及LLRKxGxKG序列缺失的突變NSPI真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.10NSPI-mu)。為檢測(cè)MHV NSPl對(duì)IFN-B生成的影響，我們分別用pcDNA3.I-NSPl和pcDNA3.1-NSPl-mu轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞，利用新城疫病毒(new-castle disease virus，ND

6、V)刺激誘導(dǎo)后，檢測(cè)細(xì)胞上清中IFN-B的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，瞬時(shí)表達(dá)MHV NSPI或缺失突變NSPI分別使IFN-B的表達(dá)水平下降了12.8%和18.4%，兩者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明MHV NSPl對(duì)IFN-B的生成具有一定的抑制作用，但LLRKxGxKG序列與此功能無關(guān)。
　　 為進(jìn)一步分析MHV NSPI對(duì)IFN-13信號(hào)通路的影響，我們用報(bào)告質(zhì)粒(-110-IFNB)-CAT和ISRE-Luc分別與真核表達(dá)質(zhì)粒

7、pcDNA3.I-NSPl或lx:DNA3.I-NSP l-mu進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。通過檢測(cè)CAT和Luc報(bào)告基因表達(dá)水平，分析MHV NSPI及保守序列LLRKxGxKG對(duì)IFN-8啟動(dòng)予和IFN刺激應(yīng)答元件活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行刺激誘導(dǎo)的情況下，與空載體對(duì)照組相比，pcDNA3.I-NSPl和pcDNA3.I-NSPI-mu轉(zhuǎn)染組的報(bào)告基因表達(dá)水平均顯著下降(P<0.01)，且兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這表明，MHV N

8、SP1可顯著抑制IFN-B啟動(dòng)子和IFN刺激應(yīng)答元件的活性，并且該抑制作用不受LLRKxGxKG序列缺失的影響。
　　 上述實(shí)驗(yàn)中我們偶然發(fā)現(xiàn)，在不進(jìn)行刺激誘導(dǎo)的情況下，LLRKxGxKG序列缺失前后MHV NSP1對(duì)報(bào)告基因的抑制作用有顯著變化。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，SARS-CoV NSPl具有抑制宿主基因表達(dá)的功能。為檢驗(yàn)MHV NSPI是否具有相同功能，我們另外選擇了三種報(bào)告質(zhì)粒（pRLuc-CMV、pGL3-basic和pGL

9、3-control）分別與pcDNA3.1-NSPI或pcDNA3.1-NSP l-mu共轉(zhuǎn)染，并檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空載體對(duì)照組相比，pcDNA3.1-NSPl和pcDNA3.1-NSPl-mu轉(zhuǎn)染組的報(bào)告基因表達(dá)水平均顯著下降(P<0.01)，但當(dāng)LLRKxGxKG序列缺失后，該抑制作用顯著降低(P<0.01)。該結(jié)果表明，MHV NSP1具有抑制共轉(zhuǎn)染基因表達(dá)的功能，LLRKxGxKG序列在此過程中發(fā)揮重要作用。這

10、提示我們，LLRKxGxKG序列是MHV NSPI的重要功能域，它對(duì)宿主基因的表達(dá)可能具有同樣的抑制作用，值得進(jìn)行深入研究。二、LLRKxGxKG序列缺失的鼠肝炎冠狀病毒突變體的拯救
　　 為深入了解MHV NSPl內(nèi)保守序列LLRKxGxKG與病毒致病性的關(guān)系，我們利用以痘苗病毒為載體的MHV反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，構(gòu)建了LLRKxGxKG序列缺失的MHV突變體，以便對(duì)LLRKxGxKG序列的功能進(jìn)行研究。
　　 首先，利用含

11、鼠肝炎冠狀病毒基因組全長(zhǎng)cDNA的重組痘苗病毒(VacciniaVirus-inf-1(V.V.-inf-1)介導(dǎo)的同源重組，以大腸桿菌gpt(guanine-phosphoribosyltransferase)基因作為雙向篩選標(biāo)記，通過GPT-in和GPT-out兩輪重組，用NSP1突變基因替換掉原MHV基因組的NSPI基因，經(jīng)過篩選、純化，獲得含突變MHV基因組的重組痘苗病毒（V.V.-MHV-NSPl mu）。然后，擴(kuò)增V.V.-

12、MHV-NSPl mu并提取病毒DNA，經(jīng)酶切獲得突變的MHV基因組全長(zhǎng)cDNA，并以此為模板通過體外轉(zhuǎn)錄，得到突變的MHV基因組全長(zhǎng)RNA，進(jìn)而轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。經(jīng)對(duì)轉(zhuǎn)染后得到重組MHV的鑒定，證明成功地拯救到了LLRKxGxKG序列缺失的MHV突變體，命名為MHV-NSP1⊿27。通過測(cè)定病毒生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，MHV-NSP1⊿27在體外仍可高效復(fù)制，其病毒滴度可達(dá)8×106PFU/ml，略低于野生型MHV(2x107pFU/ml)

13、．三、LLRKxGxKG序列缺失的鼠肝炎冠狀病毒突變體的毒力分析
　　 為進(jìn)一步了解LLRKxGxKG序列與病毒致病性的關(guān)系，我們選擇了3-4周齡雄性C57BL/6小鼠，分別開展野生型MHV與LLRKxGxKG序列缺失的MHV突變體的感染實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，腹腔感染(5×106PFU)時(shí)，野生型MHV的致死率為87.5%，而MHV-NSP1⊿27的致死率為37.5%；腦內(nèi)感染(2×104pFU)時(shí)，野生型MHV的致死率為100%，而

14、MHV-NSP1/127對(duì)小鼠完全不致死。由此得出結(jié)論：LLRKxGxKG序列缺失后，MHV突變體對(duì)C57BL/6小鼠的致病力大大降低。經(jīng)過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MHV-NSP1⊿27感染后小鼠肝和脾的病毒滴度顯著低于野生型MHV，并且MHV-NSP1⊿27很快就被機(jī)體清除，2天后已檢測(cè)不到病毒。同時(shí)，感染小鼠的血清ALT檢測(cè)結(jié)果顯示，MHV-NSP1⊿27致小鼠肝臟損傷的程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生型MHV。攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MHV-NSP1⊿27保留了較好

15、的免疫原性，對(duì)野生型MHV感染具有良好的保護(hù)效果。
　　 本研究表明，LLRKxGxKG序列是MHV的一個(gè)重要毒力位點(diǎn)，該序列缺失后，MHV突變體對(duì)小鼠的致病力顯著降低，同時(shí)可有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)，因而LLRKxGxKG序列缺失的冠狀病毒突變體可作為一個(gè)很好的減毒疫苗候選株。鑒于MHV與SARS-CoV NSPI內(nèi)LLRKxGxKG序列的高度保守性，本研究結(jié)果對(duì)于SARS-CoV等Ⅱ組冠狀病毒致病機(jī)制的研究以及減毒疫苗的研制