SARS冠狀病毒PUMC01株的分離鑒定基因組序列分析及應(yīng)用.pdf

1、重癥急性呼吸綜合征(SARS)傳染性強(qiáng)，病死率高，在短短數(shù)月內(nèi)波及到全球28個(gè)國(guó)家和地區(qū)，8000多人感染，病死率高達(dá)9.6％，被稱(chēng)為本世紀(jì)第一場(chǎng)瘟疫。在醫(yī)學(xué)高度發(fā)達(dá)的今天，傳染病再一次引起人們的極大恐慌。這場(chǎng)災(zāi)難不但給人們的心理造成巨大傷害，也減緩了國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。而造成這場(chǎng)災(zāi)難的元兇就是SARS冠狀病毒(SARS-CoV)。 2003年3月，不同的實(shí)驗(yàn)室從嚴(yán)重急性呼吸綜合征的患者中分離出一種新的冠狀病毒(SARS-CoV)。

2、已經(jīng)證實(shí)不同地區(qū)的SARS患者中存在SARS-CoV的感染。在SARS患者的呼吸道樣本中檢測(cè)出了SARS-CoV的RNA；同時(shí)，SARS患者恢復(fù)期的血清中含有SARS-CoV的抗體。一系列的證據(jù)表明這一種新的冠狀病毒與爆發(fā)的SARS存在著病因上的聯(lián)系。2003年4月12日，加拿大和美國(guó)科學(xué)家首次公布了SARS病毒(Tor2)的基因組序列。2003年4月16日，WHO正式確認(rèn)該病毒為SARS的病因并將其命名為SARS相關(guān)冠狀病毒(SARS

3、-CoV)。 由于SARS冠狀病毒是冠狀病毒的一個(gè)新變種，其病原學(xué)特征、致病機(jī)制、流行規(guī)律與以往的冠狀病毒有很大的不同。而SARS冠狀病毒全基因組測(cè)序的完成，為SARS的診斷、治療、疫苗、發(fā)病機(jī)制和其他相關(guān)研究提供了非常有用的資料。 為了解不同SARS-CoV分離株的變異水平及分布，從而為研究不同SARS-CoV分離株在臨床流行特點(diǎn)上的差異提供遺傳學(xué)上的基礎(chǔ)。對(duì)在北京協(xié)和醫(yī)院分離的一株SARS-CoV(PUMC01)進(jìn)行

4、分離、鑒定、全基因組測(cè)序以及序列分析。結(jié)果顯示該該分離株為，SARS冠狀病毒。其基因組序列(GenbankAccessionNo.：AY350750)長(zhǎng)度為29,738bp。與Rota等和Marra等獲得的SARS-CoV序列具有一致的序列長(zhǎng)度和基因組的結(jié)構(gòu)。SARS-CoV有三個(gè)編碼框架，分別編碼主要的兩個(gè)復(fù)制酶基因，結(jié)構(gòu)蛋白與預(yù)測(cè)的一些非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)(ORF)。 選擇Rota等與Marra等獲得的SARS-CoV序列為參考序

5、列，與我們得到的病毒株的全基因組序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了核苷酸的差異以及由此導(dǎo)致的蛋白質(zhì)或氨基酸的變化。這些變異主要分布在編碼復(fù)制酶的基因(Replicase1A&1B)及編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因上。在一共觀察到的10個(gè)變異位點(diǎn)中，有7個(gè)為非同義突變，其中有5個(gè)位點(diǎn)為非保守性的突變。 對(duì)17株SARS-CoV的全基因組序列和SARS-CoV-PUMC01分離株的全基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以觀察其間的進(jìn)化關(guān)系。發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的無(wú)根系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

6、的結(jié)構(gòu)與Ruan等的分析基本一致。通過(guò)觀察這18株SARS-CoV間的分子關(guān)系，將其分為主要的兩類(lèi)，兩類(lèi)間以及同類(lèi)的不同分離株之間均具有不同的分化時(shí)間。協(xié)和醫(yī)院的SARS-CoV-PUMC01分離株與其他的四株北京分離株(BJ01～04)屬于不同的類(lèi)，而與其他地區(qū)的SARS-CoV具有更近的進(jìn)化關(guān)系。 恒河猴模型是目前研究SARS疾病最理想的動(dòng)物模型。但其費(fèi)用較高。用SARS-CoVPUMC01分離株感染小鼠、大鼠、豚鼠、兔等四

7、個(gè)品種、十個(gè)品系的動(dòng)物，其中Lewis大鼠出現(xiàn)了類(lèi)似人類(lèi)SARS的主要病理學(xué)及免疫學(xué)改變。對(duì)Lewis大鼠進(jìn)行較系統(tǒng)的病原體、免疫學(xué)及病理學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)感染后的動(dòng)物可以檢測(cè)到病毒核酸的復(fù)制與外排，并檢測(cè)到特異性IgG，最高滴度達(dá)1∶320。上述結(jié)果與SARS病人及恒河猴模型很相似，但總體病理變較SARS病人輕。這可能與臨床病例往往發(fā)生繼發(fā)感染，尸檢所見(jiàn)到的是混合感染的結(jié)果，而動(dòng)物模型上看到的是單純病毒感染造成的病理?yè)p傷有關(guān)。 用S