油葵PEPC基因保守序列的克隆及RNAi載體的構(gòu)建.pdf

1、油葵(Helianthus annuus L.)是我國(guó)五大油料作物之一，具有耐寒耐旱，耐鹽堿耐瘠薄，適應(yīng)性廣，對(duì)土壤要求不高等特性。早在本世紀(jì)50年代，品質(zhì)遺傳學(xué)家就有報(bào)道稱，油菜籽中蛋白質(zhì)的含量與油脂含量呈高度的負(fù)相關(guān)關(guān)系，在其中起重要作用的關(guān)鍵酶則是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)?，F(xiàn)在在油菜和大豆上已經(jīng)有PEPC敲除實(shí)例，其對(duì)產(chǎn)油量確實(shí)產(chǎn)生了一定的促進(jìn)作用。
　　 鑒于油葵PEPC基因未知，本研究根據(jù)親緣較近物種的PEP

2、C基因同源克隆了油葵PEPC基因mRNA的部分序列，同源比對(duì)找到兩個(gè)進(jìn)化保守區(qū)，構(gòu)建RNAi表達(dá)載體，以期能夠提高油葵的含油量。本研究得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 (1)用同源克隆的方法得到了油葵PEPC基因以及mRNA的部分序列。由于油葵中對(duì)該基因的研究還沒有報(bào)道，因此需要以此序列再到GENEBANK中進(jìn)行比對(duì)。比對(duì)結(jié)果顯示，所擴(kuò)增片段與GENEBANK中其他物種PEPC序列同源性極高，尤其是與油葵同科植物黃花菊屬和青蒿的同源性為

3、最高，與黃花菊屬中不同植物的PEPC基因相似度達(dá)到92％以上，說明所得序列可以判斷為油葵PEPC基因部分序列。
　　 (2)在油葵PEPC基因中通過比對(duì)找到兩個(gè)保守區(qū)，根據(jù)RNAi要求dsRNA的大小，以及pTCK-303載體中的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物，克隆這兩個(gè)片段，并連入了T載體測(cè)序無(wú)誤。分別正反向連入載體pTCK-303，成功構(gòu)建油葵PEPC基因的RNAi載體pTCK303-FP1-RP1和pTCK303-FP2-RP2。

4、r>　　 (3)通過比較，確定油葵的組織培養(yǎng)植株再生的最佳外植體為莖尖周緣分生區(qū)。其愈傷誘導(dǎo)率和不定芽的誘導(dǎo)率都高于其他外植體。最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+IAA(0.03 mg·L-1)+6-BA(1.4～1.6 mg·L-1)，誘導(dǎo)率可達(dá)76.67％。在培養(yǎng)基1/2MS+NAA(0.3 mg·L-1)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，所有不定芽均可生根，且須根較多，利于組培苗的移栽成活。經(jīng)過油葵花粉管通道法轉(zhuǎn)化的探索，確定其可以得到陽(yáng)性種子，為下一