油葵PEPC基因保守序列的克隆及RNAi載體的構(gòu)建.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、油葵(Helianthus annuus L.)是我國五大油料作物之一,具有耐寒耐旱,耐鹽堿耐瘠薄,適應(yīng)性廣,對土壤要求不高等特性。早在本世紀50年代,品質(zhì)遺傳學(xué)家就有報道稱,油菜籽中蛋白質(zhì)的含量與油脂含量呈高度的負相關(guān)關(guān)系,在其中起重要作用的關(guān)鍵酶則是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)?,F(xiàn)在在油菜和大豆上已經(jīng)有PEPC敲除實例,其對產(chǎn)油量確實產(chǎn)生了一定的促進作用。
   鑒于油葵PEPC基因未知,本研究根據(jù)親緣較近物種的PEP

2、C基因同源克隆了油葵PEPC基因mRNA的部分序列,同源比對找到兩個進化保守區(qū),構(gòu)建RNAi表達載體,以期能夠提高油葵的含油量。本研究得到實驗結(jié)果如下:
   (1)用同源克隆的方法得到了油葵PEPC基因以及mRNA的部分序列。由于油葵中對該基因的研究還沒有報道,因此需要以此序列再到GENEBANK中進行比對。比對結(jié)果顯示,所擴增片段與GENEBANK中其他物種PEPC序列同源性極高,尤其是與油葵同科植物黃花菊屬和青蒿的同源性為

3、最高,與黃花菊屬中不同植物的PEPC基因相似度達到92%以上,說明所得序列可以判斷為油葵PEPC基因部分序列。
   (2)在油葵PEPC基因中通過比對找到兩個保守區(qū),根據(jù)RNAi要求dsRNA的大小,以及pTCK-303載體中的酶切位點,設(shè)計引物,克隆這兩個片段,并連入了T載體測序無誤。分別正反向連入載體pTCK-303,成功構(gòu)建油葵PEPC基因的RNAi載體pTCK303-FP1-RP1和pTCK303-FP2-RP2。

4、r>   (3)通過比較,確定油葵的組織培養(yǎng)植株再生的最佳外植體為莖尖周緣分生區(qū)。其愈傷誘導(dǎo)率和不定芽的誘導(dǎo)率都高于其他外植體。最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+IAA(0.03 mg·L-1)+6-BA(1.4~1.6 mg·L-1),誘導(dǎo)率可達76.67%。在培養(yǎng)基1/2MS+NAA(0.3 mg·L-1)上進行生根培養(yǎng),所有不定芽均可生根,且須根較多,利于組培苗的移栽成活。經(jīng)過油葵花粉管通道法轉(zhuǎn)化的探索,確定其可以得到陽性種子,為下一

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