副溶血性弧菌及其外膜蛋白的多克隆抗體制備與應(yīng)用.pdf

1、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,簡(jiǎn)稱(chēng)Vp)是一種廣泛分布于海洋與鹽湖中的致病性嗜鹽細(xì)菌,海產(chǎn)品(特別是貝類(lèi))中常有此菌,它是引起食源性疾病的主要病原之一,食用這種被染有副溶的生鮮或未煮熟的海產(chǎn)品可能會(huì)導(dǎo)致急性腸胃炎,其癥狀為腹瀉,頭痛,嘔吐,惡心以及腹部絞痛[1]。根據(jù)國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)對(duì)我國(guó)13個(gè)地區(qū)食源性疾病爆發(fā)情況的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù),自1992～2001年的十年間共上報(bào)食物中毒事件5770起,患者人數(shù)達(dá)16

2、2995人,其中由微生物引起的食源性疾病事件和涉及人數(shù)最多,分別占總體的38.5％和50.9％。在細(xì)菌性食物中毒的構(gòu)成中,又以副溶血性弧菌引起的急性腸胃炎占首位[3]。而根據(jù)1998年以來(lái)的數(shù)據(jù),副溶血性弧菌食物中毒已在數(shù)量上超過(guò)沙門(mén)氏菌中毒案例,成為我國(guó)的首要食源性致病菌,特別是在一些沿海城市,由該菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒總數(shù)的比例高達(dá)60％以上[5—8]。
　　 本文通過(guò)小鼠毒力試驗(yàn)比較了5株副溶血性弧菌菌株的致病性

3、；比較不同因子對(duì)制備副溶血性弧菌的外膜蛋白的效果,利用SDS—PAGE觀察比較不同菌株外膜蛋白的電泳圖譜,確定致病性副溶可能有的共同的保護(hù)性抗原。進(jìn)一步制備出副溶血弧菌菌體及多克隆抗體,通過(guò)辛酸硫酸銨兩步法純化抗體,ELISA測(cè)定抗體效價(jià),Westernblot檢測(cè)血清識(shí)別的主要蛋白帶。將所獲得的菌體血清和外膜蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行主動(dòng)保護(hù)性試驗(yàn)和被動(dòng)保護(hù)性試驗(yàn),比較其效果。
　　 本課題主要圍繞以下幾方面開(kāi)展了一些研究:
　　

4、 1副溶血弧菌致病性的研究
　　 將5株Vp菌株接種于TSA+3％NaCl斜面,28℃培養(yǎng)24h,用無(wú)菌PBS液(pH7.2—7.4)洗脫至TCBS平板中,培養(yǎng)24h后PBS洗脫制成菌懸液,調(diào)整菌液濃度為l×109個(gè)/ml,然后腹腔注射小白鼠,劑量為0.4ml/只,對(duì)照組注射無(wú)菌PBS液.注射后消毒小白鼠體表,置于鼠籠中喂養(yǎng).逐日觀察,記錄發(fā)病及死亡情況.結(jié)果表明不同副溶血性弧菌菌株對(duì)于小鼠的致病性不同,死亡率最高可達(dá)83.3％

5、.將試驗(yàn)菌接種到血液瓊脂平板培養(yǎng)基上,經(jīng)過(guò)28℃培養(yǎng)18—24h后,5株副溶菌株均能在我萋血平板上形成溶血圈,表明其含有TDH基因,具有明顯的致病性.
　　 2副溶血弧菌菌體多克隆抗體的制備及純化
　　 受免動(dòng)物血清抗體效價(jià)是評(píng)價(jià)特異性免疫效果的一個(gè)主要指標(biāo),抗體效價(jià)的高低通常顯示了免疫的成敗.利用0.05％(V/V)甲醛、30℃將標(biāo)準(zhǔn)菌株V.p1.2164滅活4h,制備免疫抗原,對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行耳靜脈注射后,采血吸取

6、上層血清并離心去除紅細(xì)胞,辛酸硫酸銨二步法純化所得抗體[9]:采用間接ELISA法測(cè)定效價(jià)為1.6×105,且與其他菌株均無(wú)交叉反應(yīng),能夠滿(mǎn)足免疫試驗(yàn)的需要.間接ELISA最佳參數(shù)為:60℃烘干包被,抗原包被濃度為107 cfu/mL；封閉時(shí)間2.5h；一抗工作稀釋度為1:4000；抗原、一抗孵育時(shí)間為75min；酶標(biāo)二抗工作稀釋度為1:1000；一抗與酶標(biāo)二抗孵育時(shí)間為60min；酶與底物反應(yīng)溫度為30℃,時(shí)間為15min；孵育溫度為

7、37℃.
　　 3副溶血弧菌外膜蛋白的提取及免疫鑒定
　　 將副溶菌株接種在3種不同培養(yǎng)基平板上,利用PMSF法提取外膜蛋白.結(jié)果表明,在TSA+3％NaCl中的表達(dá)的蛋白含量略高于其他三種培養(yǎng)基,在培養(yǎng)4h后即開(kāi)始有OMP出現(xiàn),到24h后到達(dá)高峰,此后逐漸呈下降趨勢(shì).在不同溫度下培養(yǎng)Vp時(shí)發(fā)現(xiàn)在28℃表達(dá)的外膜蛋白含量更高,且主要蛋白帶更明顯.5株具有明顯致病性的Vp在外膜蛋白SDS電泳圖譜上十分相似,主要有9—15條

8、蛋白帶,主要集中在66kD和20kD之間,其中5條主要蛋白帶為所有菌株所共有,其大致分子量為:85kD,50kD,40kD,33kD,24kD.不同菌株主要蛋白質(zhì)的數(shù)量和含量有所不同.Westernblot表明純化后的血清與所有菌株均有兩條明顯的免疫反應(yīng)帶,其大致分子量約為33kD和40kD.這兩條外膜蛋白有可能是致病性副溶血弧菌的主要保護(hù)性抗原,具備作為疫苗的候選材料的可能性.
　　 4主動(dòng)保護(hù)性和被動(dòng)保護(hù)性試驗(yàn)