副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus主要外膜蛋白的克隆、表達(dá)和免疫原性研究.pdf

1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus主要外膜蛋白的克隆、表達(dá)和免疫原性研究姓名：毛芝娟申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生物醫(yī)學(xué)工程指導(dǎo)教師：于漣20070401浙江大學(xué)博士學(xué)位論文摘要副溶血弧菌p硒砌parahaemolyticus是我國(guó)海水養(yǎng)殖魚(yú)、蝦、貝類的重要病原，每年由此菌引起的弧菌病給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的損失。在浙江省沿海網(wǎng)箱養(yǎng)殖中，該菌與哈維氏弧菌、溶藻弧菌等重要病原弧菌一起，主要危害大黃魚(yú)幼魚(yú)，每年

2、的高溫季節(jié)可弓l起大量的死亡。前期研究中以福爾馬林滅活的副溶血弧菌全菌苗免疫大黃魚(yú)，獲得了較好的保護(hù)效果。本研究開(kāi)展該菌主要保護(hù)性抗原成份之——外膜蛋白的克隆、表達(dá)和免疫原性研究，為高效疫苗的研制提供依據(jù)。以飽和硫酸銨梯度鹽析法結(jié)合瓊脂糖柱sephadex(3200凝膠過(guò)濾法初步純化了大黃魚(yú)血清免疫球蛋白，再經(jīng)割膠回收法得到進(jìn)一步純化的重鏈片段，分子量約為75kDa，免疫新西蘭兔后獲得兔抗大黃魚(yú)免疫球蛋白血清，為ELIsA和Wester

3、nblotting檢測(cè)技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。采用十二烷基肌氨酸鈉法(Sarkosyl)提取不同來(lái)源的4株副溶血弧菌分離株的主要外膜蛋自，通過(guò)SDSPAGE比較分析主要條帶和分子量組成。SDSP：AGE顯示4株菌的主要外膜蛋白由56條組成，分子量分布在2154kDa，其中，21kDa、28kDa和35kDa的條帶是所有菌株共有的，表明副溶血弧菌中部分主要外膜蛋白條帶可能是保守的。制備了不同抗血清，對(duì)4菌株的外膜蛋白進(jìn)行免疫印跡分析表明，副溶血弧

4、菌的主要外膜蛋白具有免疫原性，全菌兔抗血清主要與一分子量為21kDa的主要外膜蛋白條帶發(fā)生印跡反應(yīng)；感染后恢復(fù)期大黃魚(yú)血清識(shí)別分子量為21kDa、28kDa、35kDa和44kDa的蛋白條帶，可能與抗感染免疫應(yīng)答有關(guān)；其中21kDa的條帶是所有抗血清均識(shí)別的，提示了該蛋白良好的免疫原性。以N端氨基酸測(cè)序法初步確定了21kDa的主要免疫原性外膜蛋自為ompW，設(shè)計(jì)引物從浙江省養(yǎng)殖大黃魚(yú)分離株萄2003株基因組DNA克隆到該蛋白成熟肽的編碼

5、序列，基因登錄號(hào)為QQ2!Q窆。亞克隆到原核表達(dá)載體pET30a中獲得重組載體pET30aompW，轉(zhuǎn)染大腸桿菌EscherichiacoliBL21，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)出預(yù)期分子量(27kDa)的重組蛋自，重組蛋白以包涵體形式存在。以鎳柱親合層析法獲得純化的重組蛋白，免疫新西蘭兔獲得高免血清，該血清在免疫印跡中識(shí)別重組蛋白，提示了重組蛋白得到正確表達(dá)。重組蛋白同時(shí)被全菌兔抗血清和感染恢復(fù)期大黃魚(yú)血清所識(shí)別，進(jìn)一步驗(yàn)證了與21kDa外