從T細胞角度探討廣藿香酮對炎癥性腸病的免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究目的
　　炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一種病因未明的慢性腸道免疫性疾病。一般認為IBD的發(fā)生是環(huán)境因素作用于遺傳易感者，在腸道菌群的參與下，啟動了腸道免疫及非免疫系統(tǒng)，最終導(dǎo)致自身免疫性炎癥反應(yīng)。其中，IBD的自身免疫性特點與T細胞免疫應(yīng)答密切相關(guān)，特別是腸道粘膜上Th細胞亞群失衡。因此，從調(diào)節(jié)T細胞亞群失衡角度，尤其是Th細胞亞群，深入了解IBD多因素多靶點的發(fā)病機制，對進一步

2、闡明IBD的免疫發(fā)生機制有重要意義。
　　廣藿香是治療暑濕蘊結(jié)誘發(fā)的胃腸疾患的嶺南道地藥材，具芳香化濁、開胃止嘔、發(fā)表解暑的功效。廣藿香酮(Pogostone，PO)是廣藿香的主要有效成分。本課題組前期研究證實，廣藿香的揮發(fā)油成分可明顯緩解三硝基苯磺酸(2，4，6-Trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)誘導(dǎo)的IBD癥狀。因此，本論文擬從調(diào)節(jié)T細胞亞群平衡角度，觀察廣藿香酮對IBD的治療作用，并對其作用

3、機制進行初步探討，不僅有助于進一步認識IBD的免疫發(fā)生機制，更為科學(xué)闡釋廣藿香藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的科學(xué)內(nèi)涵提供依據(jù)。
　　方法
　　1.廣藿香酮對三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)IBD的治療作用
　　1)取雄性SD大鼠，設(shè)正常組(Normal)，模型組(Model)，柳氮磺吡啶組(SASP，200mg/Kg)，廣藿香酮組(PO，20，40，80mg/Kg)。除Normal組外，其余各組通過直腸灌注TNBS(25mg/Kg)制備I

4、BD模型。從造模當天開始，各組動物連續(xù)7天灌腸給予相應(yīng)藥物，正常組及模型組給予等體積藥物溶劑;
　　2)以體重變化、糞便性狀、血便/便血情況建立疾病活動指數(shù)(DiseaseActivity Index，DAI)評分體系，評價動物。于實驗第8天，剖取各組大鼠肛門至盲腸段結(jié)腸，對大鼠結(jié)腸組織炎癥作大體評分(Macroscopic score，MS)。結(jié)合DAI和MS評分結(jié)果，在PO實驗組中選擇效果最優(yōu)劑量組的樣品進行以下實驗;

5、　　3)所得結(jié)腸的病變部位(距肛門端約8cm)，部分通過蘇木素/伊紅(hematoxylin-Eosin，H&E)染色法，進行病理組織學(xué)評分(histological score，HS)，同時通過免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，IHC)檢測，分析CD4、叉頭框蛋白P3(Foxp3)、IFN-γ、IL-17表達情況。此外，部分組織用于檢測組織中髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)活性變化;應(yīng)用酶聯(lián)

6、免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)檢測組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-B)含量，同時應(yīng)用液態(tài)懸浮芯片技術(shù)檢測組織中白介素-17A(IL-17A)，IL-10，IL-4，IL-12p70，γ-干擾素(IFN-γ)含量;
　　4)應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測大鼠腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph nodes，MLN)中輔助性T細胞(helper T cell，Th)中IFN-γ

7、、IL-4、IL-17和Foxp3表達率，分析Th1、Th2、Th17，以及調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)比例;同時檢測其中的Ki67、CD38/MHCⅡ表達率，以分析MLN中Th細胞的增殖和激活狀態(tài);
　　5)應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)(quantitative Realtime PolymeraseChain Reaction，quantitative rt-PCR)，分析結(jié)腸組織和MLN中轉(zhuǎn)

8、錄因子(Transcriptfator, TF)T-bet, STAT1、GATA3、STAT6、STAT3、RORγt、Foxp3的mRNA相對表達量。
　　2.廣藿香酮對刀豆蛋白A(ConcanavalinA，ConA)誘導(dǎo)的T細胞增殖的抑制作用
　　1)廣藿香酮與未刺激的C57BL/6小鼠脾淋巴細胞共孵育48h和72h后，應(yīng)用MTS細胞增殖試劑盒測定脾細胞的相對存活率，分析廣藿香酮(5～80μM)的安全濃度;
　

9、　2)以終濃度為1μg/mL的ConA為刺激劑建立T細胞增殖模型，以廣藿香酮(20，40，80μM)干預(yù)72h。應(yīng)用流式細胞術(shù)，以Anti-CD3、Anti-CD4、Anti-CD8抗體標記T細胞、CFSE標記法分析受刺激T細胞及其亞群的增殖情況;以AnnexinⅤ標記法分析受刺激T細胞的凋亡情況;以AnnexinⅤ/碘化吡啶(PI)雙標記法分析其周期分布情況。此外，以Anti-CD3抗體標記T細胞，通過胞內(nèi)蛋白標記法分析ConA刺激后

10、T細胞中CDK2、CyclinE、CDK1、Cyclin B的表達情況;
　　3)以流式微球陣列分析法(Cytometry Beads Array，CBA)分析細胞上清液中IL-6，IL-10，單細胞趨化因子蛋白-1(Monocyte chemotactic protein，MCP-1)，IFN-γ，以及腫瘤壞死因子(Tumor nerosis factor，TNF)的分泌。
　　結(jié)果
　　1.廣藿香酮對三硝基苯磺酸(

11、TNBS)誘導(dǎo)IBD的治療作用
　　1)在25mg/KgTNBS刺激下，模型組大鼠與正常組相比，出現(xiàn)體重明顯下降、稀便、血便等典型的IBD體征，伴有明顯的腸粘連、潰瘍/壞死嚴重、腸壁水腫增厚明顯等結(jié)腸病變。HE染色顯示模型組大鼠結(jié)腸黏膜出現(xiàn)明顯的透壁性炎癥，包括潰瘍、隱窩變型，黏膜及黏膜下層可見大量炎性細胞浸潤，肌層肥大增厚，伴有血管增生。組織中MPO活性明顯升高進一步說明了模型組結(jié)腸組織出現(xiàn)嚴重的炎癥浸潤。相比之下，廣藿香酮可明

12、顯提高IBD模型動物的生存質(zhì)量，使其糞便性狀逐漸恢復(fù)正常，并防止血便發(fā)生，DAI評分明顯低于模型組;同時，廣藿香酮組(40mg/Kg)的MS和HS均明顯低于Model組，廣藿香酮可減輕結(jié)腸水腫、潰瘍、壞死，降低組織中MPO活性，其中廣藿香酮(40mg/Kg)效果最優(yōu)。HE染色結(jié)果表明廣藿香酮(40mg/Kg)可促進結(jié)腸黏膜愈合，減少潰瘍面積，促進隱窩形態(tài)恢復(fù)正常，減少炎性細胞浸潤，使肌層變薄，說明廣藿香酮可有效緩解IBD的腸道炎癥反應(yīng)。

13、細胞因子譜分析結(jié)果表明，模型組大鼠結(jié)腸組織中IL-4、IL-12p70、IL-10、IL-17、TGF-β含量明顯高于正常組，而廣藿香酮(40mg/Kg)則可抑制IFN-γ、IL-12p70、IL-17、IL-10的分泌。此外，免疫組化分析結(jié)果表明，模型組大鼠結(jié)腸組織中CD4、IFN-γ、IL-17、Foxp3的表達明顯高于正常組，提示模型組大鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)明顯的Th細胞浸潤;與此相比，廣藿香酮(40mg/Kg)可明顯抑制組織中CD4、

14、IFN-γ、 IL-17的表達，減少Th細胞，尤其是Th1、Th17細胞在病變黏膜中的浸潤。Th細胞轉(zhuǎn)錄因子mRNA相對表達量分析表明，模型組動物組織中T-bet、GATA3、STAT6、Foxp3的相對表達量明顯高于正常組，RORγt的表達量則明顯低于正常組;而廣藿香酮(40mg/Kg)對1BD模型動物組織中相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的mRNA相對表達影響較小，僅使RORγt明顯提高至接近正常組。
　　2)針對MLN的分析表明，模型組大鼠ML

15、N中Th細胞的Ki67陽性率、CD38/MHC-Ⅱ共陽性率與正常組比較無明顯差別，廣藿香酮(40mg/Kg)對此也無明顯影響;同時，模型組大鼠MLN中Th細胞的IFN-γ、IL-17、Foxp3表達率與正常組比較無明顯差異，而IL-4表達率則明顯升高;而廣藿香酮(40mg/Kg)對MLN中Th細胞的IFN-γ、IL-4、IL-17、Foxp3的表達率無明顯影響。針對MLN中Th細胞轉(zhuǎn)錄因子的mRNA相對表達量分析結(jié)果表明，與正常組比較，

16、模型組大鼠MLN中GATA3表達明顯下調(diào)的同時RORγt明顯上升，而T-bet、STAT6、STAT3、Foxp3則無明顯變化;廣藿香酮(40mg/Kg)使上述轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達恢復(fù)至接近正常組水平，其中使Foxp3的相對表達量與模型組有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果提示在本條件下，IBD模型動物MLN中Th細胞的激活、增殖狀態(tài)，及各亞群的分化狀態(tài)無明顯變化，廣藿香酮(40mg/Kg)對MLN中Th的上述指標也無明顯影響。
　　2.廣藿香酮

17、對刀豆蛋白A誘導(dǎo)的T細胞增殖的抑制作用
　　1)結(jié)果表明，0～80μM廣藿香酮對正常脾細胞的相對活力無影響，說明廣藿香酮在該濃度范圍內(nèi)對淋巴細胞無毒性作用。在ConA誘導(dǎo)T細胞增殖模型中，由于“激活誘導(dǎo)的細胞死亡(AICD，Activation Induced Cell Death)”效應(yīng)的存在，脾淋巴細胞出現(xiàn)了輕微凋亡，同時T細胞的增殖比例，及其在脾淋巴細胞中的比例明顯升高。而廣藿香酮(20，40，80μM)在不引起細胞毒性或凋

18、亡的情況下，可明顯降低T細胞的增殖比例及其細胞比例，說明廣藿香酮可直接抑制ConA誘導(dǎo)的T細胞增殖，且進一步分析表明PO對Th中的CD4+T細胞和CD8+T細胞同樣有直接增殖抑制作用。
　　2)細胞周期分析結(jié)果表明，廣藿香酮直接的增殖抑制活性可能與其誘導(dǎo)周期阻滯作用有關(guān)。ConA刺激后，處于S期和G2/M期的淋巴細胞比例明顯增加，且進一步分析表明與S期的周期調(diào)控蛋白CDK2表達明顯下降，而cyclin E，以及與G2/M相關(guān)的CD

19、K1、cyclinB均明顯增加。相比之下，廣藿香酮(20，40，80μM)使S期和G2/M期的T細胞比例明顯下降，同時明顯減少cyclin E、CDK1、cyclinB的表達。上述結(jié)果提示，廣藿香酮可通過抑制增殖細胞中CDK1和CyclinB的表達，阻礙G2/M期檢查點行使功能，從而使已處于增殖狀態(tài)下的T細胞無法進入G2/M期，發(fā)生S期停滯，最終直接抑制了T細胞增殖。
　　3)此外，細胞因子譜分析表明，ConA刺激可使脾淋巴細胞的

20、IL-6、IL-10、MCP-1、IFN-γ、TNF的分泌量顯著增加，而廣藿香酮(20，40，80μM)則可明顯抑制其中的促炎因子IFN-γ和抗炎因子IL-10的分泌。
　　結(jié)論
　　廣藿香酮可明顯改善IBD模型動物的生存質(zhì)量，緩解IBD的腸道炎癥反應(yīng)，減輕結(jié)腸水腫、潰瘍、壞死，減少病變黏膜中炎癥細胞浸潤，促進黏膜愈合，說明廣藿香酮對IBD具有一定的治療作用。體外實驗結(jié)果進一步提示，廣藿香酮的對IBD的治療作用可能與其直接的

21、免疫抑制作用有關(guān)。廣藿香酮可通過誘導(dǎo)處于增殖狀態(tài)的T細胞發(fā)生S期阻滯，對T細胞產(chǎn)生直接的增殖抑制作用，減少致炎性Th細胞Th1、Th2、Th17和免疫抑制性的Treg在病變黏膜中的浸潤，從而減少促炎因子和抗炎因子的分泌，調(diào)節(jié)細胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡，最終鈍化適應(yīng)性免疫應(yīng)答，全面抑制IBD發(fā)展過程中的攻擊性免疫反應(yīng)。上述實驗結(jié)果提示，廣藿香的特征性成分廣藿香酮對實驗性IBD模型具有明顯的治療作用，該作用與其直接抑制T細胞增殖、緩解IBD活動期間適