IL-17-IL-17R通路在炎癥性腸病中的免疫調(diào)節(jié)機制研究.pdf

1、背景:
　　炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Diseases,IBD)是一種病因尚不明確的慢性腸道炎癥性疾病,包括潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis,UC)和克羅恩病(Crohn's Diseases,CD)兩種。IBD在西方國家相當常見,患病率達100-200/10萬。近10年,我國炎癥性腸病的發(fā)病率上升大約10-20倍。鑒于IBD嚴重危害患者的健康且發(fā)生惡變的概率明顯高于正常人,該類疾病越來越

2、受到人們的關注。
　　在發(fā)病機制上目前認為IBD是由環(huán)境、遺傳、感染及免疫等多因素相互作用所致,已知腸道粘膜免疫系統(tǒng)異常所導致的炎癥反應在IBD發(fā)病中起重要作用。最初認為CD4+Thl/Th2細胞亞群的失衡與CD和UC的發(fā)生密切相關。近年來一種新型CD4+T細胞亞群Th17細胞及其分泌的細胞因子IL-17在炎癥性腸病中的作用逐漸被研究者所關注。如IBD的臨床病例顯示,UC和CD病人結腸粘膜組織IL-17分泌細胞的水平明顯高于正常;

3、IBD病人外周血中IL-17的含量也明顯升高,這提示IL-17可能在IBD的發(fā)病過程中發(fā)揮病理性作用。隨后眾多的研究探討了IL-17作為IBD干預靶點的可行性。然而后來的研究發(fā)現(xiàn)利用IL-17的單抗對IBD進行臨床治療并未取得預期的治療效果,這提示11-17在炎癥性腸病中具有復雜的作用,要干預IL-17在IBD中的病理性作用仍需要對其作用機制進行深入的探討。
　　已知IL-17可通過活化MAPKp38等通路誘導中性粒細胞的聚集等機

4、制促進炎癥反應。Actl(activator of NF-KB)是IL-17信號通路中一種重要的接頭蛋白,參與了IL-17誘導的MAPK通路分子的活化。但在炎癥性腸病中,Actl分子是否以及如何參與IL-17介導的腸上皮細胞的活化,其機制如何等是目前尚不十分清楚的課題。另一方面,也有資料顯示IL-17能在炎癥性腸病中發(fā)揮保護作用。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)UC中IL-17的表達升高,而Thl細胞的活性顯著降低,IL-17是否通過抑制Thl細胞

5、的活性發(fā)揮免疫保護作用,其機制如何是目前尚不清楚而又非常值得探討的內(nèi)容。因此,深入認識IL-17介導免疫調(diào)節(jié)作用的機制將為以IL-17為靶點的炎癥性腸病的免疫干預策略提供理論及實驗依據(jù)。
　　目的:
　　鑒于結細胞(Colonic Epithelia Cell,CEC)是IBD累及的主要靶細胞,且是重要的局部免疫反應介導細胞。因此我們以CEC為對象,研究IL-17在CEC中的效應及信號轉導機制,探討IL-17在腸道介導雙重作

6、用的分子機制,從而為基于IL-17的臨床疾病干預提供理論及實驗依據(jù)。
　　方法及結果:
　　1.我們首先以CEC細胞系HT-29細胞為模型,通過real-time PCR及Western Blot方法探討了IL-17促進HT-29細胞活化介導促炎因子表達的細胞內(nèi)信號轉導機制。我們的結果表明,IL-17對HT-29細胞的單獨作用不明顯,而可以促進TNF-a介導的細胞活化。具體的結果包括:
　　1)IL-17可明顯促進TN

7、F-a誘導的多種中性粒細胞趨化因子(CXCLI、2、5、6、IL-8)及Th17細胞趨化因子(CCL20)的基因表達,同時IL-17與TNF-a在P38、ERK和AKT磷酸化水平具有明顯的協(xié)同效應;
　　2)利用相應的激酶抑制劑證實P38通路是IL-17對TNF-a誘導的IL-8基因表達發(fā)揮協(xié)同作用的分子機制;
　　3)利用shRNA建立了Actl低表達的穩(wěn)定細胞系,從基因和蛋白水平均證實具有明顯的敲低效果。利用Actl敲低

8、細胞株進一步證實Actl依賴的P38通路是IL-17發(fā)揮促炎作用的重要分子機制。
　　2.相對于IL-17的促炎作用,IL-17在自身免疫病中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的報道還非常少,而且機制遠不清楚。鑒于我們前期的研究提示IL-17可能通過抑制Thl細胞的活性發(fā)揮免疫保護作用,因此本研究重點探討了IL-17在HT-29細胞是否通過活化不同的細胞內(nèi)信號轉導通路抑制了Thl細胞相關炎癥因子的表達。本研究的第二部分將按照發(fā)現(xiàn)現(xiàn)象…探討機制…體內(nèi)

9、驗證三步來闡明并回答這些問題。具體的研究內(nèi)容及結果包括:
　　1)首先通過口服DSS水建立小鼠潰瘍性結腸炎模型,利用real-time PCR方法檢測小鼠脾臟、腸系膜淋巴結和結腸固有層淋巴組織中IL-17和IFN-y的基因表達水平,結果表明,無論在外周還是在局部免疫組織DSS腸炎小鼠中均出現(xiàn)IL-17基因表達水平明顯增加,而IFN-Y水平顯著下降或有下降趨勢,這與我們前期探討免疫調(diào)控分子Tim-3與Th細胞亞群異常關系的研究結果一

10、致(見我們已經(jīng)發(fā)表的文章),提示IL-17在IBD小鼠體內(nèi)可能對Thl細胞的活性有抑制作用,但其機制仍不清楚。
　　2)本研究中我們同時關注了上述組織中與Thl細胞趨化和分化相關的兩種細胞因子(CXCLII和IL-12)的表達情況,結果表明,在DSS腸炎中這兩種細胞因子的表達水平均明顯下降。這些結果進一步提示在DSS腸炎中高水平的IL-17可能通過影響Thl細胞的分化和趨化而抑制Thl細胞的功能,從而出現(xiàn)IL-17水平升高而IFN

11、-Y水平降低的現(xiàn)象。
　　3)隨后我們以結腸上皮細胞系HT-29細胞作為研究對象,利用real-time PCR方法探討11-17靶向腸上皮細胞后CXCLlI和IL-12等與Thl細胞活性相關的細胞因子/趨化因子的表達變化,發(fā)現(xiàn)IL-17能顯著抑制TNF-Q介導的CXCLII和IL-12P35的基因表達,提示IL-17可能通過抑制Thl細胞的趨化和分化從而負調(diào)控Thl細胞功能發(fā)揮抗炎作用。在隨后的機制研究中我們通過Western

12、Blot、shRNA、表達譜芯片等技術探討了IL-17在HT-29細胞介導免疫調(diào)節(jié)作用(抑制Thl細胞活性)的細胞內(nèi)信號轉導機制。
　　主要的結果包括:
　?、買L-17能協(xié)同增強TNF-a誘導的ERK-C/EBPp和AKT磷酸化水平,利用相應的激酶抑制劑進一步證實這種信號水平的協(xié)同是IL-17負調(diào)控CXCLlI和IL-12P35基因表達的重要分子機制;
　?、谟胹hRNA敲低Actl表達后IL-17對TNF-a誘導的

13、ERK和AKT磷酸化水平未見明顯協(xié)同效應,同時,IL-17不能抑制TNF-a誘導的CXCLII和IL-12P35基因的表達。這些結果證實Actl依賴的ERK和PI3K-AKT通路是IL-17發(fā)揮負調(diào)控作用的重要機制;
　?、劾没蛐酒夹g對Actl敲低后HT-29細胞的表達譜進行了分析,發(fā)現(xiàn)Actl敲低后與PI3K-AKT通路密切相關的基因PI3K-CG(PI3KIB亞單位)的表達水平顯著降低,同時IL-17促進PI3K-CG基

14、因表達的作用也顯著減弱。這些結果提示IL-17可能通過Actl依賴的方式促進PI3K-CG的表達從而影響PI3KIB-AKT通路的活性。
　　4)最后,為進一步證實IL-17靶向腸上皮細胞抑制IL-12基因的表達而負調(diào)控Thl細胞的分化,我們模擬體內(nèi)環(huán)境進行了HT-29細胞與PBMC共孵育。結果表明,IL-17可通過抑制腸上皮細胞IL-12基因的表達而負調(diào)控Thl細胞的分化及功能。
　　5)為了進一步在體內(nèi)驗證IL-17是否

15、通過抑制CEC中Thl相關炎癥介質的表達發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,我們進行了如下的實驗:
　?、貲SS腸炎小鼠在建模后1、3、5、7天經(jīng)腹腔注射IL-17單克隆抗體,結果顯示IL-17抗體阻斷后DSS炎癥反應明顯加重,同時腸上皮細胞中CXCLlI、IL-12P35及IFN-Y的表達水平均顯著升高,從而表明IL-17抗體阻斷后影響了CEC的功能,增強Thl細胞活性,從而加重了DSS腸炎;
　　②為了進一步驗證CEC在IL-17介導免疫

16、調(diào)節(jié)中的關鍵作用,我們將DSS腸炎來源的腸上皮細胞經(jīng)腹腔注射到DSS模型小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn),DSS來源的腸上皮細胞能明顯加重腸道炎癥反應,伴隨CXCLII、IL-12P35及IFN-y等炎癥介質表達的升高,而同時給予重組IL-17蛋白能顯著逆轉CEC的上述病理作用。體內(nèi)試驗的結果進一步證實了IL-17-腸上皮細胞-Thl細胞軸的免疫調(diào)控機制。
　　結論:
　　我們的上述研究較為系統(tǒng)地闡述了IL-17在炎癥性腸病中的免疫調(diào)節(jié)機制。

17、一方面我們發(fā)現(xiàn)IL-17作用于腸上皮細胞后能通過Actl依賴的MAPK-p38活化通路穩(wěn)定多種趨化因子的轉錄后mRNA,從而促進以中性粒細胞浸潤為主的局部炎癥反應;另一方面IL-17則又能通過Actl-PI3KIB-AKT和Actl-ERK-C/EBPp兩條相對獨立的信號通路抑制TNF-a誘導的CXCLII和IL-12P35基因的表達,從而負調(diào)控Thl細胞的功能。本研究通過對IL-17雙向調(diào)控機制的深入探討,進一步解釋了靶向IL-17的