MIJ大鼠Klhl10、Insl3、Acr、Zmynd15基因的克隆與序列分析.pdf

1、目的:有接近15％新組成的家庭會承受不孕癥的困擾，大部分是由于分子和遺傳因素導致的不孕。雖然有許多基因涉及不育，但是目前只有一小部分基因被確定。遺傳因素導致男性不育受到越來越多的關注。盡管做了許多努力，但是臨床上只有少數(shù)相關基因多態(tài)性被確定。這主要是由于男性不育癥的多因素的性質(zhì)，研究設計難度大以及沒有好的實驗模型的原因，因此迫切需要建立能用于男性不育研究的動物模型。
　　MIJ大鼠的雄性后代中穩(wěn)定出現(xiàn)不育個體，經(jīng)遺傳測交實驗證實為

2、常染色體上的單一隱性基因突變所致。MIJ近交系大鼠有望成為生殖領域研究的良好動物模型。因此突變基因的定位將極大地幫助MIJ大鼠的保種、繁殖及其推廣應用。通過前期的表達譜基因芯片篩選，篩選到10個和雄性不育相關的差異表達基因，然而并不清楚是否是由于表達差異基因的突變導致了MIJ大鼠的不育。為了進一步研究MIJ雄性不育大鼠的基因突變情況，本實驗對MIJ雄性不育大鼠，MIJ雄性正常大鼠和MIJN雄性大鼠Klhl10(kelch-like fa

3、mily member10)、Insl3(insulin-like3)、Acr(acrosin)和Zmynd15（zinc finger, MYND-type containing15）四個基因進行了克隆測序和序列比對研究。
　　方法:根據(jù)搜索RGD(Rat Genome Database)得到大鼠的DNA基因序列，用Primer5.0軟件對Klhl10、Insl3、Acr、Zmynd15四個基因的序列進行引物設計，并送公司進行合

4、成，對MIJ雄性不育大鼠、MIJ雄性正常大鼠和MIJN雄性大鼠基因組DNA分別進行PCR擴增，將擴增出來的特異性片段連接T克隆載體，對連接成功的質(zhì)粒進行酶切鑒定，將酶切鑒定克隆成功的陽性質(zhì)粒送公司測序，將三種大鼠的基因片段測序結(jié)果進行比對，對各個片段進行拼接分析，以期得到MIJ雄性不育大鼠相對于MIJ雄性正常大鼠、MIJN雄性大鼠的突變所在。
　　結(jié)果:
　　1、完成了對MIJ雄性不育大鼠，MIJ雄性正常大鼠和MIJN雄性大

5、鼠的Klhl10、Insl3、Acr、Zmynd5四個基因的克隆
　　將PCR產(chǎn)物連接T載體，篩選酶切鑒定連接成功克隆的質(zhì)粒，完成了對MIJ雄性不育大鼠，MIJ雄性可育大鼠和MIJN大鼠的Klhl10、Insl3、Acr、Zmynd15四個基因克隆。Klhl10、Insl3、Acr和Zmynd15基因分別制備36，2，8，8個克隆，3種大鼠共制備54個克隆。
　　2、完成了對MIJ雄性不育大鼠，MIJ雄性可育大鼠和MIJN大

6、鼠Klhl10、Insl3、Acr、Zmynd15四個基因的54個克隆片段的測序
　　將克隆成功的MIJ雄性不育大鼠，MIJ雄性可育大鼠和MIJN大鼠的Klhl10、Insl3、Acr、Zmyndl5四個基因的54個克隆片段進行了克隆測序。
　　3、對MIJ雄性不育大鼠，MIJ雄性正常大鼠和MIJN雄性大鼠的Klhl10、Insl3、Acr、Zmynd15四個基因的測序結(jié)果進行拼接及比對分析
　　Klhl10基因的堿基

7、有16367pb，共制備36個克隆，重疊堿基為3251bp;Insl3基因的堿基有1940pb，共制備2個克隆，重疊堿基為75bp; Acr基因的堿基有6187pb，共制備8個克隆，重疊堿基為646pb;Zmynd15基因的堿基有6614pb，共制備8個克隆，重疊堿基為623pb，通過DNAstar軟件進行拼接，并去除多余部分堿基。
　　將MIJ雄性不育大鼠，MIJ雄性可育大鼠和MIJN大鼠Klhl10、Insl3、Acr、Zmy

8、nd15四個基因的序列拼接結(jié)果用DNAMEN軟件進行序列比對，未發(fā)現(xiàn)突變堿基。
　　結(jié)論:
　　1、首次報道了MIJ雄性不育大鼠，MIJ雄性正常大鼠和MIJN雄性大鼠Klhl10、Insl3、Acr、Zmynd15四個基因的DNA序列。
　　2、排除了MIJ雄性不育大鼠的突變基因位于Klhl10、Insl3、Acr、Zmynd15四個基因序列的可能性。
　　本實驗為進一步對MIJ大鼠突變基因的鑒定研究，確定人類與