人源半乳糖凝集素類似蛋白GRP的結(jié)構(gòu)與功能研究及人源gal-8的初步晶體學研究.pdf

1、(Ⅰ)凝集素是自然界廣泛存在的一人類非免疫來源的、無酶活性的多價的糖類結(jié)合蛋白質(zhì)，能使細胞發(fā)生凝集。凝集素可從不同的角度來分類，根據(jù)來源可分為動物凝集素、植物凝集素和微生物凝集素。半乳糖凝集素galectin為S型動物凝集素，它廣泛存在于各種動物體內(nèi)，galectin家族成員具有高度保守的特征性的氨基酸序列，擁有一個大約130個氨基酸的核心序列，通常稱之為糖識別結(jié)構(gòu)域(CRD：carbohydrate recognition domai

2、n)，能特異性地結(jié)合β-半乳糖苷，且進化保守，種類繁多，功能復雜，可能參與細胞與細胞、細胞與細胞間質(zhì)之間的相互作用，細胞粘附、凋亡及免疫反應等多種生物學過程。 根據(jù)分子結(jié)構(gòu)，目前galectin可劃分為3種基本類型：1)原型galectin (Prototype：含有單一的糖識別結(jié)構(gòu)域CRD)： 2)嵌合型galectin(Chimera：一個CRD與一個膠原蛋白樣重復結(jié)構(gòu)域融合)； 3)前后重復型galectin (Tande

3、m-repeat：兩個CRD串聯(lián)融合)。原型galectin包括：galectin-1，2，5，6，7，10，11，13，14，15等；嵌合型galectin儀有一個成員galectin-3；前后重復型galectin包括galectin-4，6，8，9，12。在過去的一些年里，半乳糖凝集素家族的一些蛋白的晶體結(jié)構(gòu)逐漸被解析出來。迄今為止，gal-1， gal-2，gal-3， gal-7， gal-9的N端結(jié)構(gòu)域以及gal-10等的晶

4、體結(jié)構(gòu)已經(jīng)投入PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中。從這些已經(jīng)報道的晶體結(jié)構(gòu)來看，它們都采取了類似的大豆凝集素的凝膠卷拓撲結(jié)構(gòu)。它們的保守CRD結(jié)構(gòu)域包含由11或12條β-strand的雙層β-sheet組成的β-三明治結(jié)構(gòu)，其中一些蛋白含有短的3<,10>螺旋。這些已知晶體三維結(jié)構(gòu)的蛋白中，糖結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)特征也比較相似，以Gal-1-V-galactoside復合體為例，蛋白與糖配體的結(jié)合主要靠His44，Asn46，Arg48，Val59，Asn

5、61，Trp68，Glu71和Arg73等氨基酸殘基直接與結(jié)合的二糖相互作用。 GRP(即：HSPC159)是個新的人類galectin相關(guān)基因，最近通過測定人的造血干細胞CD34+全長的mRNA序列得到鑒定。盡管它編碼的蛋白質(zhì)含有一個比普通稍長的N端序列，但仍可以被劃歸到“原型”galectin。它的序列中不含有公認的分泌或者核定位信號肽序列。人類的GRP基因定位于染色體2P13上，包含有5個外顯子，含有在galectin家族

6、中保守的外顯子和內(nèi)含子連接處。GRP的序列在進化上非常古老并且在不同的物利中高度保守，非常相似的cDNA序列已經(jīng)在人類、鼠、雞、青蛙和魚當中發(fā)現(xiàn)。GRP含有其它galectin最保守的64個殘基中的51個，是一個galectin相關(guān)蛋白質(zhì)。然而，像GRIFIN一樣，GRP的序列只具有那些保守的糖識別殘基中的2個，因此可能不結(jié)合半乳糖苷。GRP的生物功能目前還不清楚。在本論文中，我們構(gòu)建表達并純化了人源GRP的C端保守結(jié)構(gòu)域CRD(氨基酸

7、殘基38-172)，然后我們使用懸滴氣相擴散的方法長出了它的晶體。在北京和合肥同步輻射實驗室收集到了最高分辨率達1.8A的衍射數(shù)據(jù)。晶體有兩個空間群，分別是C2空間群，晶胞參數(shù)是：a=123.07，b=96.67，c=61.56 A，β=118.72°；F222空間群，晶胞參數(shù)是：a=96.89，b=127.76，c=213.29，α=β=γ=90°。計算的Matthews coefficient分別為2.6 A<'3>/Da對應518

8、％的溶劑含量，和2.55 A<'3>/Da對應52.5％的溶劑含量。然后，我們使用分子置換的方法解析了GRP-C的晶體相位并通過精修得到了1.9 A的三維結(jié)構(gòu)模型。GRP采用了和半乳糖凝集素類似的折疊方式即由兩個反向平行的β-sheet組成的β-三明治結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)以β-sheet為主，此外還含有一個小的3<,10>螺旋。GRP蛋白的晶體堆積方式非常獨特，它的不對稱單位中含有4個分子，先兩兩形成一個含有一個非晶體學對稱軸的同源二聚體，然

9、后這兩個二聚體垂直排列并且以凹面相對，形成中間帶有一個圓孔的四體結(jié)構(gòu)。糖結(jié)合試驗和共結(jié)晶試驗以及對晶體結(jié)構(gòu)的分析表明GRP確實不具有結(jié)合糖配體的能力。它的功能作用方式與凝集素存在著根本的不同。因此我們又根據(jù)蛋白的表面電荷分布情況推測了GRP可能的在體內(nèi)發(fā)揮生理功能的方式即通過親水和疏水相互作用進行特異性識別以及通過與金屬離子的結(jié)合來發(fā)揮生物學功能。 galectin相關(guān)蛋白(Ⅱ) Galectin-8屬于前后重復型凝集素亞家族。它

10、包含有一些異構(gòu)體，每個異構(gòu)體都由兩個140個左右氨基酸殘基長的結(jié)構(gòu)域組成，每個結(jié)構(gòu)域都包含有一個糖識別結(jié)構(gòu)域。這兩個結(jié)構(gòu)域由一個長度不等的連接肽連接起來。人的galectin-8包含33kbp的基因組DNA，定位于染色體1q42.11上，包含11個外顯子?；蛲ㄟ^可變剪接共產(chǎn)生14個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，編碼6個蛋白。像其它凝集素一樣，galectin-8是一個分泌蛋白。通過分泌，galectin-8扮演細胞粘結(jié)的生理調(diào)控因子的角色。當它不固定時，

11、作為基質(zhì)蛋白發(fā)揮生理功能，等同于纖維粘連蛋白通過連接和聚集一些特定的細胞表面整合素受體來刺激細胞粘附。Galectin-8和整合素復合物的形成包含糖一蛋白相互作用并引發(fā)了整合素介導的信號級聯(lián)反映例如FAK和paxillin的酪氨酸激酶的磷酸化。相反，當galectin-8作為過剩的可溶配體時，像纖維粘連蛋白一樣，它能與整合素形成復合物負調(diào)節(jié)細胞粘附。這樣的一個機制使得分泌的galectin-8發(fā)出的本地信號可以傳到細胞粘附和遷移的特定區(qū)

12、域。由于它對細胞粘附的雙重作用和它與纖維粘連蛋白的聯(lián)系，galectin-8可以被看作一種新型的細胞基質(zhì)蛋白。Galectin-8的表達水平與某些人類腫瘤、前列腺癌正相關(guān)。過量表達的凝集素可以刺激那些腫瘤組織的生長和轉(zhuǎn)移，這也是靠它的調(diào)節(jié)細胞粘結(jié)和生長的能力來完成的。因此，galectin-8可以調(diào)控細胞一基質(zhì)的相互作用，也可以調(diào)節(jié)多種生理和病理環(huán)境下的細胞功能。在本研究中，我們表達并純化了人源galectin-8以及它的C末端保守結(jié)構(gòu)

13、域CRD。然后運用懸滴氣相擴散的方法結(jié)晶了CCRD蛋白。蛋白的結(jié)晶條件是：27.5％PEG8000， 100mM Na Cacodylate buffer pH6.5，0.2M ammonium phosphate， 5％Ethylene Glycol。晶體在實驗室銅靶光源100K的溫度下收集了一套3 A的常規(guī)衍射數(shù)據(jù)。品體屬于正交品系，空間群為P222，晶胞參數(shù)為a=54.15，b=73.13，c=179.42 A。計算得到的Matt