捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)半乳糖結(jié)合凝集素的山羊外周血淋巴細(xì)胞受體鑒定及功能研究.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)病是由捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)（Haemonchus contortus）引起的、重要的反芻動(dòng)物胃腸道寄生線蟲(chóng)病。該病分布廣泛，危害嚴(yán)重。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)也是一種重要的消化道寄生線蟲(chóng)模式種，對(duì)其與宿主間相互作用的研究，有助于揭示消化道線蟲(chóng)影響宿主免疫反應(yīng)及引起免疫逃避的具體機(jī)制。由寄生性線蟲(chóng)等蠕蟲(chóng)排泄分泌的半乳糖結(jié)合凝集素(galectin)能夠顯著調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室從捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雄蟲(chóng)和雌蟲(chóng)體內(nèi)分別克隆得到一種galectin，命

2、名為Hco-gal-m(GenBank No.AY253330)和Hco-gal-f（GenBank No.AY253331）。研究表明，重組Hco-gal-m/f（rHco-gal-m/f）能對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)感染提供部分的免疫保護(hù)力;rHco-gal-m/f能與山羊外周血淋巴細(xì)胞結(jié)合，參與調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞多種細(xì)胞因子相關(guān)信號(hào)通路，抑制細(xì)胞因子的分泌;同時(shí)影響細(xì)胞的分化和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果提示Hco-gal-m/f直接參與了宿主免疫

3、反應(yīng)的調(diào)節(jié)，參與蟲(chóng)體的免疫逃避。然而，Hco-gal-m/f與宿主細(xì)胞的哪些受體蛋白結(jié)合，之后活化或調(diào)節(jié)了哪些相關(guān)信號(hào)通路從而引起宿主免疫反應(yīng)的具體分子機(jī)制還不清楚。因此，對(duì)Hco-gal-m/f在山羊外周血淋巴細(xì)胞上膜受體的篩選及研究，有助于闡明Hco-gal-m/f與宿主細(xì)胞相互作用和寄生蟲(chóng)-宿主相互作用的分子基礎(chǔ)及作用機(jī)制。
　　1酵母雙雜交系統(tǒng)的構(gòu)建
　　為了研究Hco-gal-m/f與宿主細(xì)胞間相互作用的分子機(jī)制，

4、在研究中首先構(gòu)建了分裂-泛素酵母雙雜交系統(tǒng)。從山羊外周血淋巴細(xì)胞中提取并純化總RNA，合成第一鏈eDNA，再通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增得到雙鏈cDNA，同時(shí)在cDNA兩端加上接頭。用限制性?xún)?nèi)切酶SfiⅠ處理cDNA，將其插入文庫(kù)質(zhì)粒pPR3-N，電轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒進(jìn)入大腸桿菌DH10B，建成原始文庫(kù)。對(duì)原始文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR鑒定重組質(zhì)粒內(nèi)插入片段的大小。之后構(gòu)建了兩個(gè)誘餌重組質(zhì)粒pDHB1-gal-m和pDHB1-gal-f，并檢驗(yàn)

5、了Hco-gal-m/f在酵母中的表達(dá)，確定其能夠用于酵母雙雜交篩選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取的總RNA分子完整，純度高;成功合成雙鏈cDNA。文庫(kù)質(zhì)粒中插入片段大小分布在500～2500 bp，平均長(zhǎng)度約為1000 bp。原始文庫(kù)滴度達(dá)到1×106 cfu/mL，擴(kuò)增后的文庫(kù)滴度為1×109 cfu/mL。所構(gòu)建文庫(kù)的各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)標(biāo)，可以用于篩選 Hco-gal-m/f的結(jié)合蛋白。
　　2 Hco-gal-m/f結(jié)合蛋白的篩選及驗(yàn)證<

6、br>　　使用研究初期構(gòu)建的酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選，共獲得81個(gè)陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆經(jīng)過(guò)一輪返板驗(yàn)證，最終得到能與Hco-Gal-m/f結(jié)合的三個(gè)蛋白:TMEM147(transmembrane protein147)、 SERP1(Stress-associated endoplasmic reticulum protein1)和TMEM63A(transmembrane protein63A)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Hco-Gal-m

7、/f與候選蛋白的結(jié)合，本研究中使用免疫共沉淀技術(shù)，從兩個(gè)方向檢驗(yàn)了rHco-Gal-m刺激12h后的山羊外周血淋巴細(xì)胞中這三個(gè)蛋白與Hco-Gal-m的結(jié)合。結(jié)果表明，Hco-Gal-m能夠與PBMC中的TMEM147、SERP1和TMEM63A發(fā)生特異性結(jié)合。此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了TMEM147、SERP1和TMEM63A是Hco-Gal-m在山羊外周血淋巴細(xì)胞上結(jié)合蛋白。這三個(gè)結(jié)合蛋白的發(fā)現(xiàn)有助于闡明線蟲(chóng)galectin與宿主間相互作用

8、的機(jī)制。
　　3 Hco-gal-m/f結(jié)合蛋白的定位及功能研究
　　研究中的免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TMEM147分布于細(xì)胞膜上和細(xì)胞內(nèi)，SERP1分布于細(xì)胞內(nèi)，而TMEM63只分布于細(xì)胞膜上。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明這三個(gè)蛋白在絕大多數(shù)的山羊外周血淋巴細(xì)胞上均有表達(dá)。細(xì)胞經(jīng)RNA干擾后的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)TMEM147、SERP1和TMEM63A是Hco-gal-m/f的結(jié)合蛋白及膜受體。細(xì)胞經(jīng)RNA干擾后進(jìn)行的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)