人凝集素芯片的構(gòu)建及初步應(yīng)用研究.pdf

1、凝集素作為自然狀態(tài)下存在的一類能夠與不同糖結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的蛋白質(zhì),在細(xì)胞的糖基化分析方面具有其天然優(yōu)勢(shì)。本研究旨在構(gòu)建一種人凝集素芯片,并初步應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞遷移與人凝集素之間關(guān)系的研究。本研究將從系統(tǒng)層次研究人凝集素的功能,加深對(duì)凝集素與糖蛋白相互作用的認(rèn)識(shí),為篩選抗癌藥物提供靶分子,為癌癥的防治提供有效手段。
　　本研究首先搜集106個(gè)人體內(nèi)凝集素蛋白的編碼序列,在已有的人凝集素Entryclone的基礎(chǔ)上,采用Gateway克

2、隆技術(shù)通過(guò)LR反應(yīng)將其連接到pEGH-A表達(dá)載體中,然后導(dǎo)入酵母表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行過(guò)量表達(dá);酵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白后,向收集到的菌體中加入鋯珠進(jìn)行震蕩裂解、再利用谷胱甘肽親和介質(zhì)富集帶有GST標(biāo)簽的凝集素蛋白,采用一步法裂解純化可以充分提高膜蛋白的產(chǎn)率并保持其活性。得到的酵母表達(dá)庫(kù)共有兩個(gè)來(lái)源,主要來(lái)源是實(shí)驗(yàn)室有一套人蛋白酵母表達(dá)庫(kù),跟數(shù)據(jù)庫(kù)匹配得到69個(gè),能夠成功表達(dá)的有51個(gè);從原始Entryclone導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng)中的有24

3、個(gè),其中,能夠成功表達(dá)重組蛋白的有23個(gè)。
　　比較不同基片后,選擇信號(hào)強(qiáng)度及信噪比等各方面綜合效果最好的PSH‐OP基片來(lái)構(gòu)建人凝集素芯片,每張芯片設(shè)計(jì)12個(gè)相同的區(qū)域,每個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)成13行、18列的矩陣,排布著74個(gè)凝集素蛋白,2個(gè)陰性對(duì)照,1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照,最后通過(guò)質(zhì)控證明芯片上的蛋白點(diǎn)全部有效。
　　利用人凝集素芯片,根據(jù)已建立好的標(biāo)準(zhǔn)流程來(lái)分析三陰性乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231)及其不同轉(zhuǎn)移能力及器官嗜性的衍生細(xì)

4、胞系(SCP4,SCP6,SCP28以及4175)表面的糖鏈信息,找到6種特征性的糖特異性結(jié)合的凝集素(GalNAc-T6、galectin-1、galectin-2、galectin-7、galectin-8、ERGIC-53),可進(jìn)一步應(yīng)用于乳腺癌的研究。
　　本研究將篩選得到的克隆表達(dá)序列通過(guò)Gateway技術(shù)構(gòu)建重組蛋白表達(dá)系統(tǒng),經(jīng)過(guò)蛋白分離純化后,構(gòu)建了一款人凝集素芯片,并應(yīng)用到乳腺癌細(xì)胞表面糖鏈結(jié)構(gòu)的分析,對(duì)乳腺癌的早