槲寄生凝集素功能域蛋白的研制與其生物學(xué)功能的初步研究.pdf

1、槲寄生(Mistletoe) 在中國用于治療淋病、抗風(fēng)濕、降血壓已有悠久的歷史，由于其具有獨(dú)特的生物學(xué)作用引起了人們的廣泛關(guān)注。槲寄生凝集素（Mistletoe Lectin, MLs）是槲寄生的一種有效成份?？v觀國際研究進(jìn)展： 歐洲、韓國、日本均有文獻(xiàn)報(bào)道了當(dāng)?shù)豈Ls的生物學(xué)作用，如誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌炎癥因子以及體內(nèi)外免疫調(diào)節(jié)作用等。綜合其令人關(guān)注的特性表明，MLs除了具有天然抗感染與直接的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞毒作用外，其間

2、接的免疫調(diào)節(jié)作用在拮抗腫瘤中預(yù)示著極大的理論臨床應(yīng)用前景。
　　 本研究一直跟蹤和研究中國槲寄生的獨(dú)特的醫(yī)藥作用，并用經(jīng)典生化方法提取并純化了槲寄生凝集素蛋白（MLsP），通過傳統(tǒng)的染色技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、MTT等法分析了該蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征，AP峰值和拮抗腫瘤細(xì)胞增殖等生物學(xué)效應(yīng)以研究其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的病理免疫學(xué)機(jī)制。結(jié)果表明：MLsP具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和顯著抑制和阻斷腫瘤細(xì)胞增殖的作用，并以Caspase依賴的

3、方式發(fā)揮其有效的抗腫瘤作用。為了獲得大量和穩(wěn)定的MLsP，本文旨在運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了PET28a-MLP表達(dá)載體，利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，成功表達(dá)和制備了MLs功能域蛋白MLP，經(jīng)純化后對(duì)其進(jìn)行了初步理化性質(zhì)和生物學(xué)特性分析證明：大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)和制備的功能域蛋白MLP的得率為 100ug/ml，其分子量約為31KD，HPLC和2D gel顯示純化后的MLP與歐洲標(biāo)準(zhǔn)品吸收峰值基本一致，其等電點(diǎn)PI≈7.8。經(jīng)初步免疫學(xué)

4、功能檢測發(fā)現(xiàn)其與歐洲標(biāo)準(zhǔn)品功能比對(duì)具有一定的誘導(dǎo) γδ-T細(xì)胞擴(kuò)增特性和微弱的細(xì)胞凋亡等作用，其誘導(dǎo)與拮抗腫瘤細(xì)胞凋亡和增殖的劑量依賴相關(guān)性的研究正在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中。
　　 本文在完成上述工作的同時(shí)還參與了課題組承擔(dān)的上海市科委重點(diǎn)項(xiàng)目《07JC14033IFN-β/TCRBV肽段干預(yù)RA免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究》中B細(xì)胞介導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis- RA）部分的研究。研究發(fā)現(xiàn)：RA患者除了體內(nèi)存在異

5、常活化的自身反應(yīng)性T細(xì)胞-Th1所造成的免疫損傷外還與患者Th2細(xì)胞（IL-4，IL-4受體，STAT-6水平）異常的免疫應(yīng)答功能紊亂有關(guān)。實(shí)驗(yàn)證明RA患者由于Th2細(xì)胞表達(dá)和功能異常從而使其B細(xì)胞的數(shù)量（CD19+細(xì)胞）和功能發(fā)生質(zhì)的變化，本文通過熒光定量PCR方法檢測到的RA患者PBMC中ERK基因的相對(duì)表達(dá)量比正常對(duì)照高，而磷酸化IKK-a、IkB-a及NF-kB（p65）的表達(dá)水平具有一定意義的變化，因此從信號(hào)分子角度提示B細(xì)胞