小黑楊天冬酰胺合成酶基因AS功能的研究.pdf

1、天冬酰胺合成酶(Asparagine Synthetase-B，AS-B，EC6.3.5.4)是植物體內(nèi)氮素同化的關(guān)鍵酶，其產(chǎn)物天冬酰胺(Asn)參與有機(jī)氮素的運(yùn)輸和儲(chǔ)存。研究編碼該酶基因的功能，對(duì)理解林木的氮代謝的機(jī)制有重要作用。本研究以小黑楊（P.simonii×P.nigra）為實(shí)驗(yàn)材料，克隆AS基因，分析不同家族成員對(duì)全組織表達(dá)、日節(jié)律、持續(xù)光照/黑暗48h處理、氮素及MSX處理的響應(yīng)。將PnAS1構(gòu)建植物表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介

2、導(dǎo)法轉(zhuǎn)化84K楊，經(jīng)過(guò)抗性篩選和PCR鑒定，獲得了7個(gè)轉(zhuǎn)化子;對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行不同水平氮素處理，并測(cè)定根和葉中有關(guān)生理形態(tài)和氮代謝的相關(guān)指標(biāo)。主要結(jié)論如下：
　　(1)以小黑楊為材料，通過(guò)同源克隆的方法得到3個(gè)AS基因家族成員，分別命名為PnAS1、PnAS2和PnAS3，長(zhǎng)度分別為1770bp、1755bp和1764bp，并成功提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)分別為KT161263、KT161264和KT161265。
　　(2

3、)大腸桿菌天冬酰胺突變體ER回復(fù)實(shí)驗(yàn)證明，轉(zhuǎn)入pET-14b-PnAS1、pET-14b-PnAS2和pET-14b-PnAS3質(zhì)粒的菌液均能恢復(fù)生長(zhǎng)，從而證明PnAS1、PnAS2和PnAS3具有合成天冬氨酸合成酶的功能。
　　(3)全組織表達(dá)分析顯示，PnAS1和PnAS2主要在地上部位的葉片中表達(dá)，但是二者的表達(dá)部位存在差異，即PnAS1主要存在于葉片L2和L3，PnAS2主要在幼嫩葉葉片L1中表達(dá)。同時(shí)，三個(gè)基因均在根中大

4、量表達(dá)。
　　(4)日節(jié)律的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，幼葉L1中PnAS2的表達(dá)占優(yōu)勢(shì)且有一定的波動(dòng)，PnAS1較為穩(wěn)定。L2中兩個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)一致，但PnAS1更易受黑暗條件的影響。
　　(5)持續(xù)光照/黑暗48h處理，PnAS1和PnAS3受到光照抑制和黑暗誘導(dǎo)，黑暗條件下兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平是光照條件下的50-200倍，PnAS2基因在部分葉片中受光照抑制，其不受黑暗條件的影響。
　　(6)PnAS1、PnAS2和PnAS3

5、對(duì)不同氮素形態(tài)、不同供氮水平及不同處理時(shí)間的響應(yīng)表達(dá)模式進(jìn)行研究表明:L1中，兩種氮素形態(tài)均可誘導(dǎo)PnAS1表達(dá)，但響應(yīng)時(shí)間有差異，對(duì)硝態(tài)氮響應(yīng)較快。L2葉片中，兩個(gè)基因均被抑制。L3中，AS基因?qū)ο跛徜@的的響應(yīng)高于硝和銨。小黑楊根部的PnAS1和PnAS3兩個(gè)基因強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，因此根部是AS基因誘導(dǎo)的主要部位。利用MSX進(jìn)行處理證實(shí)，根部NH4+對(duì)PnAS3強(qiáng)烈誘導(dǎo)是通過(guò)合成Gln或者Gln衍生物發(fā)揮的作用。
　　(7)利用農(nóng)桿

6、菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化84K楊樹(shù)，經(jīng)過(guò)卡納篩選、分子鑒定，確認(rèn)獲得7個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。
　　(8)正常氮素處理(0.5mM NH4NO3)條件下，轉(zhuǎn)基因植株的地上及地下鮮重均顯著增加且氨基酸的含量高于野生型植株，轉(zhuǎn)化子3除外，轉(zhuǎn)化子3和4的GOGAT的酶活高于野生型。低氮脅迫處理?xiàng)l件下(0.05mM NH4NO3)，轉(zhuǎn)化子1、3、5和7的氮素利用率明顯提高;各個(gè)轉(zhuǎn)化子的生物量、葉面積及氨基酸的量均高于野生型，除此之外，轉(zhuǎn)化子3、4、5和7的GO