頭莖互換熒光報告流感病毒在廣譜流感中和抗體篩選和檢測中的應用.pdf

1、季節(jié)性流感和大流行給人類的健康帶來巨大威脅。流感病毒是單股負鏈RNA病毒，屬于正粘科，分為三種類型，其中A型流感最為廣泛，危害最大。流感病毒表面血凝素(HA)分子是主要抗原，三維結構為三聚體結構，52-277位保守的半胱氨酸將血凝素分子分為一個球狀頭部和桿狀莖部兩部分。HA球頭部含有唾液酸受體結合位點，介導病毒與受體細胞的結合，是誘導機體產(chǎn)生中和抗體的主要靶標。不同亞型HA頭部結構域氨基酸不同，高度可變，針對HA球頭部的抗體特異性較強。

2、HA桿狀莖部在所有HA亞型中相對保守，可誘導產(chǎn)生廣譜中和抗體，但由于莖部抗原表位的暴露較差，該類抗體的制備和篩選較為困難。目前廣譜中和抗體的研究與制備是流感抗體研究中的熱點。然而，傳統(tǒng)的血凝抑制與微量中和實驗很難快速篩選檢測出針對HA莖部保守區(qū)域的抗體。利用反向遺傳技術，制備含有不同HA頭部和莖部的重組熒光報告流感病毒，通過頭莖互換HA流感熒光報告病毒的次序篩選，將能快速篩選得到針對保守莖部的廣譜中和抗體。
　　前期我們實驗室成功

3、拯救出一株攜帶Gaussia.luciferase熒光報告基因的流感病毒，命名為IAV-luc。IAV-luc是復制完全型病毒，能夠在感染的細胞和動物體內(nèi)穩(wěn)定表達熒光素酶。通過熒光素酶的檢測，能夠直觀、快速的檢測報告病毒的復制情況。本研究嘗試在IAV-luc背景下拯救攜帶不同亞型頭莖互換的HA熒光報告病毒，利用HA頭莖互換熒光流感病毒靶向HA莖部結構域，開發(fā)一種高效、便捷、靈敏的高通量廣譜中和抗體篩選方法。本研究中，成功拯救出一系列的熒

4、光流感病毒H1-PR8/H1-CA09-luci，H1-PR8/H5-HK-luci，H9-HK/H1-PR8-luci,H1-CA09/H1-PR8-Luci，將頭莖互換熒光流感病毒與待測抗體孵育后，將混合液轉移至細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后加入腔腸素底物檢測報告病毒的熒光素酶的活性。熒光素酶活性的強弱直接反映出待檢測抗體對報告病毒的抑制程度，我們可以判斷出待檢抗體的結合部位及中和活性。本研究初步使用已知中和抗體4E6、CR9114、C1

5、79、8852等驗證頭莖互換熒光流感病毒的識別能力。結果顯示，4E6只能中和H5-HK-luci，不能中和H1-PR8/H5-HK-luci，而CR9114、C179、8852對H1-PR8-luci、H5-HK97-luci、H1-PR8/H5-HK有中和活性，證實了4E6抗體識別H5-HA的頭部，CR9114、C179和8852則是識別莖部的廣譜中和抗體。
　　綜上，本研究建立一種通過HA頭莖互換熒光報告流感病毒快速檢測莖部中