多重熒光定量RT-PCR同時檢測甲型乙型流感病毒方法的建立及其初步應用.pdf

1、目的 建立一種快速、敏感、特異的多重熒光定量RT一PCR同時檢測甲型乙型流感病毒，并將建立的方法進行初步臨床應用研究。 方法 1．甲型乙型流感病毒的引物及Taqman探針的設計，選取兩種病毒的基因序列保守區(qū)，根據(jù)引物設計軟件DNASTAR設計引物和探針。對甲型乙型的探針標記不同的熒光素，甲型標記FAM，乙型標記VIC。 2．多重熒光定量RT-PCR反應體系中，甲型乙型流感病毒的兩套引物及兩種探針濃度的優(yōu)化

2、。 3．對甲3／悉尼／5／97、乙／深圳／12／97流感病毒進行病毒效價滴定(106TCID50／m1)，TCID．~oE口是組織細胞培養(yǎng)半數(shù)感染劑量，然后稀釋成100、10、1、0．1、O．0l、0．001TCID．~o，提取病毒RNA作為敏感度的標準，多重熒光定量RT一PCR反應和常規(guī)的RT-PCR以及和病毒分離培養(yǎng)的靈敏度作比較。 4．在多重熒光定量RT-PCR反應體系中加入其它的呼吸道病毒提取的RNA，檢測反應體

3、系的特異性． 5．用多重熒光定量RT-PCR在對40例疑似流感含漱液標本進行初步的應用． 結果 1．引物與探針的設計與合成：我們選取甲型流感、乙型流感高度保守區(qū)，甲型選取編碼基質(zhì)蛋白(M)區(qū)，乙型選取編碼血凝素基因區(qū)(HA)。甲型流感的探針5’端標記的熒光報告基團是FAM，3’端標記的熒光淬滅基團為TAMRA，乙型流感的探FluA-1F:5'-GGACTGCAGCGTAGACGCTT-3'核酸位點:217-236

4、FluA-2R:5'-CATCCTGTTGTATATGAGGCCCAT-3'382-405FluA-3R:5'-CATTCTGTTGTATATGAGGCCCAT-3'382-405FluAprobe:5'-CTCAGTTATTGTGCTGGTGCACTTGCCA-3'349-376FluB-1F:5'-AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA-3'970-995FluB-2R:5'-CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA

5、-3'1119-1139FluBprobe:5'CACCCATATTGGGCAATTTCCTATGGC-3'1024-1050針5’端標記的熒光報告基團是VIC，3’端標記的與甲型一樣。設計的甲型流感有兩條反向引物，只有在5’第4個堿基不同，目的是為了擴增出所有的甲型流感的亞型。引物和探針的序列： 2．多重熒光定量RT-PCR反應體系中引物及探針的濃度優(yōu)化：兩套引物的濃度分別配成200、400和600nmol／L，甲型乙型探針的

6、濃度分別配成100、200、300nm01／L，采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度，以0．4umol／L的甲型引物濃度與0．6umol／L的乙型引物濃度及兩種探針的濃度分別為200nmol／L獲得的Ct值較小而熒光強度最大。在該條件下，多重熒光定量RT-PCR反應體系最合適。 3．多重熒光定量RT-PCR反應體系的靈敏度：多重熒光定量RT-PCR反應在兩種參考病毒效價滴度稀釋0.001TCID,~o倍時，檢測甲型流感的Ct值為3

7、5．12，檢測乙型流感的Ct值為33．06，檢測呈陽性，常規(guī)的RT-PCR在稀釋至0．1TCIDs。時能擴增出條帶，0．01TCIDs。時條帶擴增不出。用MDCK培養(yǎng)分離只能在1TCIDs。能觀察到細胞病變效應。 4．多重熒光定量RT一PCR反應體系的特異性：流感病毒甲3／悉尼／5／97，甲1／北京／56／97，乙／深圳／12／97，甲3／浙江／78／00，甲3／浙江／52／04麻疹病毒滬191，風疹病毒GOS株，流行性腮腺炎病

8、毒TeryLyn株，呼吸道合胞病毒Long株的RNA提取物作為模板分別加入多重熒光定量RT-PCR進行測定，除流感病毒出現(xiàn)很好的陽性結果外，其它所有病毒的檢測結果均呈陰性。 5．流感疑似患者臨床樣本的檢測對我市疑似流感暴發(fā)疫情及流感監(jiān)測醫(yī)院送檢的40份患者含漱液應用多重熒光定量RT一PCR方法與病毒分離方法進行檢測，其中病毒分離陽性8份(20％)，多重熒光定量RT一PCR陽性17份(42．5％)，這二者檢測的陽性患者結果一致。為

9、排除多重熒光定量RT一PCR假陽性，用血凝抑制實驗檢測雙份血清(急性期、恢復期)的血凝抑制效價，經(jīng)檢測診斷為流感近期感染。 結論 1．我們建立的多重熒光定量RT一PCR同時檢測甲型乙型流感病毒的方法是利用TaqMan技術是在普通PCR原有的一對特異性引物基礎上增加了一條特異性的熒光雙標記探針。利用該探針能與病原核酸特異性結合，而且結合部位位于引物結合區(qū)域，探針的5’端和3’端分別標記不同的熒光素，在PCR擴增過程中，利用

10、檢測系統(tǒng)中熒光量的變化，通過檢測儀檢測并記錄的熒光信號的變化判定檢測結果。 2．檢測方法學評價：經(jīng)標準毒株與臨床樣本的檢測比較，發(fā)現(xiàn)它不僅特異性高，而且比常規(guī)盯一PCR和病毒分離法更敏感，快速，也更簡便。通常流感病毒的RT一PCR檢測敏感度在0．1TCID50左右，從病毒核酸提取，RT-PCR反應與電泳，整個過程大約需6～7h左右。而采用本方法從核酸提取至完成檢測，僅需3h左右，敏感度可達0．001TCID50。 3．采