馬流感病毒反向遺傳系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、馬流行性感冒是由馬流感病毒引起的馬屬動(dòng)物的一種急性呼吸道傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將馬流感列為法定報(bào)告動(dòng)物疫情之一。馬流感的爆發(fā)曾對(duì)我國(guó)的養(yǎng)馬業(yè)及賽馬業(yè)造成沉重的經(jīng)濟(jì)打擊，因此針對(duì)馬流感病毒的基礎(chǔ)研究一直是病毒學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。
　　本研究以最早分離得到的H3N8亞型馬流感毒株A/equine/Miami/1/1963(H3N8)為親本，通過(guò)RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄及PCR技術(shù)對(duì)流感病毒8條基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的基因片段同pHW20

2、00雙向表達(dá)載體連接，最終得到了8個(gè)含有流感病毒不同基因片段的重組質(zhì)粒，完成了馬流感病毒反向遺傳系統(tǒng)的構(gòu)建。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收獲的細(xì)胞上清接種MDCK細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，最終拯救出具有感染活性的病毒粒子rH3N8。對(duì)拯救出的rH3N8毒株進(jìn)行基因序列測(cè)定，結(jié)果顯示其各條基因片段的序列均與親本毒株A/equine/Miami/1/1963(H3N8)相同。rH3N8毒株的血凝測(cè)定結(jié)果、TCID50測(cè)定結(jié)果及病毒生長(zhǎng)曲線結(jié)

3、果也均與親本毒株相似。
　　在構(gòu)建好的馬流感病毒反向遺傳系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，以近年本實(shí)驗(yàn)室分離馬流感毒株A/equine/Heilongjiang/SS1/2013(H3N8)為親本，通過(guò)RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄及PCR技術(shù)對(duì)毒株的聚合酶蛋白基因進(jìn)行了擴(kuò)增，連接pHW2000雙向表達(dá)載體，使用構(gòu)建好的質(zhì)粒對(duì)A/equine/Miami/1/1963(H3N8)毒株的聚合酶蛋白基因NP、PA、PB1及PB2進(jìn)行了替換，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后拯救出了聚合

4、酶蛋白替換重組病毒tH3N8。tH3N8毒株的測(cè)序結(jié)果顯示其基因序列同質(zhì)粒所攜帶序列相同。tH3N8毒株的血凝試驗(yàn)結(jié)果顯示，其效價(jià)變化速率及同期血凝效價(jià)結(jié)果均高于rH3N8毒株。TCID50結(jié)果及病毒生長(zhǎng)曲線結(jié)果也均反映出tH3N8毒株比rH3N8毒株在MDCK細(xì)胞上具有更快的病毒復(fù)制速度。上述結(jié)果暗示著A/equine/Heilongjiang/SS1/2013(H3N8)毒株的聚合酶蛋白相對(duì)A/equine/Miami/1/1963