J亞群ALV的分離鑒定及三種方法動(dòng)態(tài)比較分析其在DF-1細(xì)胞中的增殖.pdf

1、禽白血病(Avian Leukosis，AL)是由反轉(zhuǎn)錄病毒科禽白血病病毒/肉瘤病毒群病毒(ALV/RSV)引起的，以造血細(xì)胞惡性增生為主要病變的一類禽的多種良性和惡性腫瘤性傳染病。根據(jù)病毒的囊膜蛋白、與病毒宿主特異性相關(guān)的gp85蛋白抗原性的差異以及交叉中和試驗(yàn)等，將禽白血病可分為A～J10個(gè)亞群，其中只有A、B、C、D、E和J亞群能感染雞。目前，商品雞群中以致病性外源性病毒以A亞群和J亞群感染為主，二者流行性最為廣泛，且ALV-J較

2、其它亞群的外源性ALVs有更強(qiáng)的水平傳播能力。病毒分離鑒定表明，白血病/血管瘤主要是由J亞群禽白血病病毒引起，但也同時(shí)有的是由A、B亞群白血病病毒感染引起的。這不僅僅是肉雞和蛋雞的問題，這也是我國(guó)地方品系雞（如麻雞、三黃雞等）的主要問題。由于經(jīng)典的A、B、C、D亞群白血病在我國(guó)長(zhǎng)期得不到關(guān)注且無任何凈化措施，極有可能已經(jīng)在地方品系雞中廣泛流行，甚至發(fā)生了新的變異產(chǎn)生了新的亞型。
　　 1.SDAU12株ALV-J病毒的分離鑒定<

3、br>　　 本實(shí)驗(yàn)通過接種DF-1細(xì)胞，成功的從廣州某三黃雞種雞場(chǎng)分離到(一)株外源性ALVSDAU12，測(cè)得了其env基因序列，并與其他亞群的已知參考毒株進(jìn)行了同源性比較。分析結(jié)果表明，SDAU12毒株的gp85基因與A～D亞群外源性參考毒株的同源性在49.5％～51.4％;與內(nèi)源性E亞群參考毒株的同源性僅51.1％左右，而與4株J亞群國(guó)際參考株之間的同源性較高，為87.4％～94.6％，其中與SD07LK1的同源性最高，可達(dá)94.

4、6％;gp37基因與SD07LK1的同源性最高為95.2％。SDAU12毒株gp85基因編碼的氨基酸序列與其他參考毒株的同源性與4株J亞群參考株之間的同源性較高，為84.3％～92.5％之間，其中與SD07LK1株的同源性為92.5％。其gp37基因編碼的氨基酸序列的同源性與內(nèi)源性E亞群參考毒株的同源性僅為58.2％，而與4株J亞群參考株之間的同源性較高，為91.3％～94.4％之間，其中與SD07LK1株gp37基因編碼的氨基酸序列的

5、同源性最高，為92.5％。
　　 2.利用ELISA、FA及IFA法對(duì)該病毒在DF1細(xì)胞上增殖動(dòng)態(tài)的比較分析
　　 為了比較酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、直接免疫熒光和間接免疫熒光技術(shù)三種試驗(yàn)方法在J亞群禽白血病病毒增殖過程中動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的敏感性，并以此為基礎(chǔ)分析評(píng)估者三種試驗(yàn)方法在生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)用性，首先將該毒株其接種于DF-1細(xì)胞（C/E系）上，運(yùn)用間接免疫熒光法測(cè)得其半數(shù)致死量TCID50為10-4.02，然后分別按照1×104，

6、1×103，1×102TCID50四個(gè)濃度接種于處在對(duì)數(shù)期的DF1細(xì)胞上，并設(shè)置空白對(duì)照組，每個(gè)梯度設(shè)三個(gè)重復(fù)。分別在接種后維持1d、2d、3d、4d、5d、6d時(shí)收取細(xì)胞上清液，并立刻保存至-80℃，用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法針對(duì)禽白血病病毒P27抗原的特異性檢測(cè);此外，飛片法收集每個(gè)梯度1d～6d的DF1細(xì)胞，用于直接免疫熒光法和間接免疫熒光法針對(duì)J亞群禽白血病病毒特異性單克隆抗體JE9的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法在接種維持

7、后的第三天可檢測(cè)出1×104和1×103TCID50濃度的上清液中含有少量的陽性細(xì)胞，而直至第四天才能檢測(cè)出1×102TCID50濃度上清液有陽性細(xì)胞;直接免疫熒光法第三天便能檢測(cè)到接種1×102TCID50濃度的細(xì)胞中含有陽性細(xì)胞，另外兩個(gè)濃度在第一天即可觀察到陽性細(xì)胞，但陽性細(xì)胞量較少;間接免疫熒光法在接種1×102TCID50濃度病毒后維持的第二天便有陽性細(xì)胞的檢出，而1×104和1×103TCID50濃度第一天即可檢測(cè)到大量的陽

8、性細(xì)胞。
　　 結(jié)論:
　　 1.通過對(duì)SDAU12毒株基因序列的分析，根據(jù)該病毒與其他參考毒株之間的gp85及gp37基因的核酸序列及他們所編碼的氨基酸序列同源性的比較分析，可以確定本實(shí)驗(yàn)所分離的SDAU12毒株確實(shí)是ALV-J，該毒株與參考毒株SD07LK1的同源性最高，這兩株ALV-J的關(guān)系比較密切。該病毒是從廣州某三黃雞種雞場(chǎng)疑似ALV感染病雞中分離得到的，由此可知，ALV-J已經(jīng)蔓延至我國(guó)多種地方品系雞。

9、>　　 2.接種病毒后，間接免疫熒光法對(duì)SDAU12病毒感染的陽性細(xì)胞的檢出率最高而且檢出病毒的時(shí)間最早，直接免疫熒光法次之，而酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的敏感性最低。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的可操作性強(qiáng)，步驟簡(jiǎn)單明了，但其敏感性較低，且假陽性率和假陰性率較高;而間接免疫熒光法準(zhǔn)確性和敏感性都很高，但需要配備熒光顯微鏡，技術(shù)要求較高，因此，在家禽養(yǎng)殖的生產(chǎn)實(shí)踐中，為了更好地進(jìn)行J亞群禽白血病病毒感染的監(jiān)測(cè)，我們應(yīng)選擇在對(duì)樣本進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)的同