蛋雞ALV-J的分離鑒定及分子致瘤機制的研究.pdf

1、ALV-J主要引起雞的骨髓細(xì)胞瘤(Myelocytoma)或骨髓白血病(MyeloidLeukosis，ML)和多種細(xì)胞類型的惡性腫瘤。近年來我國蛋雞群出現(xiàn)ALV-J感染病例的報道不斷增加，J亞群白血病已由最初肉用雞感染傳播向蛋雞和中國的許多地方品種雞發(fā)展，其宿主范圍正在不斷擴大。另外，ALV-J的感染除了引起常見的髓樣細(xì)胞瘤外，還出現(xiàn)血管瘤、成髓細(xì)胞性白血病、成紅細(xì)胞性白血病、纖維肉瘤等多種組織的腫瘤，甚至同一雞群或同一雞體內(nèi)出現(xiàn)多種

2、腫瘤同時發(fā)生的現(xiàn)象。
　　 目前國內(nèi)對J亞群白血病的研究，多偏向病原的分子病毒學(xué)和致病模型的病理形態(tài)學(xué)研究，未見從宿主靶細(xì)胞腫瘤相關(guān)基因的變化來探討腫瘤的發(fā)病機制。我國當(dāng)前流行的ALV-J的組織嗜性、發(fā)病過程及致瘤機制的系統(tǒng)病理學(xué)研究少見報道，這方面的研究探討對揭示該病的病因?qū)W及發(fā)病學(xué)具有重要的理論意義。
　　 該研究旨在用從自然發(fā)病蛋雞群分離鑒定的ALV-J毒株人工接種5日齡SPF雞胚，建立ALV-J感染的動物病理模型

3、，在不同時期剖殺試驗雞，通過定量檢測實驗雞群的病毒血癥、泄殖腔排毒及抗體陽性率，動態(tài)檢測靶組織腫瘤相關(guān)基因的異常表達，觀察靶組織的病理變化及腫瘤演變過程，研究ALV-J的組織嗜性、致瘤機制及病理發(fā)生過程，豐富該病的病理學(xué)研究內(nèi)容，進而為該病的有效防制提供理論依據(jù)。
　　 本研究選擇山東、河南兩個表現(xiàn)為血管瘤兼髓細(xì)胞瘤型的蛋雞典型禽白血病病例，取病雞的病料，接種DF-1細(xì)胞(C/E)系，采用ELISA抗原檢測、PCR以及亞群特異性

4、免疫熒光試驗(IFA)等方法，分離鑒定了二株ALV-J病毒，分別命名為hn10py01和sd10xt03。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的不同亞群序列設(shè)計合成3對連續(xù)、相互部分重疊的引物，完成了這兩株病毒前病毒全基因組核苷酸序列測序，測序結(jié)果表明：hn10py01和sd10xt03全基因組長度分別為7652bp和7636bp，與已公開的ALV-J全基因組序列大小相比略有差異，但符合典型的復(fù)制完全型反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)，基因序列中不含已知致

5、癌基因。與國內(nèi)外各參考毒株進行了同源性分析，兩毒株具有如下序列特征：(1)5’LTR和5’UTR與參考序列相比變異較大，hn10py015’UTRleader區(qū)有一個19bp的插入，兩株病毒在5’UTR區(qū)均有一個堿基的缺失；(2)3’UTR區(qū)rTM和DR區(qū)有一個連續(xù)的205bp的缺失，E元件相對保守，兩毒株均有一個堿基的缺失，形成新基序元件；(3)gag和pol基因非常保守；env基因變異較大，呈現(xiàn)高度多樣性，hn10py01有一個氨基

6、酸缺失。
　　 為研究蛋雞ALV-J分離株(hn10py01)的致病特性，接種5日齡SPF白菜航蛋雞雞胚，在感染后的第2、3、5、7、9、11、13、17、21、25、30、35周采集泄殖腔棉拭子、抗凝血、非抗凝血，進行泄殖腔排毒、病毒血癥、ALV-J特異性抗體檢測；每次采樣時同時隨機取部分雞剖檢，進行病理變化觀察。結(jié)果表明：(1)感染組雞只從第2周開始出現(xiàn)病毒血癥，并隨著日齡的增加，陽性率不斷增加，11周后其陽性率達到100％

7、，一直持續(xù)到實驗結(jié)束；(2)感染組雞只從第2周開始排毒率不斷上升，在16周以后100％雞只排毒；(3)感染組雞只產(chǎn)生ALV-J抗體的陽性率很低，最高達50％，后期快速下降至0；(4)感染組雞只產(chǎn)蛋后，蛋清內(nèi)p27陽性率為100％，卵黃ALV-J抗體陽性率為0；(5)能誘導(dǎo)感染雞發(fā)生骨髓瘤、血管瘤、骨髓瘤兼血管瘤和血管瘤兼纖維肉瘤多種類型腫瘤，腫瘤誘發(fā)率為25％。
　　 為研究癌基因、抑癌基因、凋亡基因及其它腫瘤相關(guān)基因在該病發(fā)病

8、學(xué)中的作用，本研究成功建立了原癌基因(c-myc、c-myb)、抑癌基因(p53、p16、p27)、凋亡調(diào)節(jié)基因(Bcl-2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體(VEGFR)基因熒光定量PCR檢測方法，動態(tài)檢測了抑癌基因、癌基因、凋亡基因和其它腫瘤相關(guān)基因在各臟器中的異常表達，對抑癌基因p53進行了突變檢測，以探討ALV-J人工感染SPF雞的分子病理學(xué)發(fā)病機制。結(jié)果表明：感染組與對照組相比具有以下特征：(1)抑癌基因p53在各組織器

9、官內(nèi)(尤其是骨髓內(nèi))呈現(xiàn)高表達，p53的高表達與日齡關(guān)系不明顯，各時間段之間沒有明顯差異。感染雞高表達的p53基因主要為突變型，總突變率為60％以上，突變方式多種多樣。7例標(biāo)本同時存在兩個以上位點的突變，DNA結(jié)合部位外顯子的點突變率為51.6％，C-末端外顯子的點突變率為17.3％；缺失突變?yōu)?0.7％，N-末端外顯子突變率為0.5％，p53基因突變和過量表達可能是使靶細(xì)胞癌變的重要原因；(2)感染組抑癌基因p16呈失表達，抑癌基因p

10、27呈低表達；(3)凋亡基因bcl-2在攻毒早期(3H齡前)，各組織呈現(xiàn)高表達，隨著日齡的增加bcl-2的表達水平與對照組之間無明顯差異；(4)原癌基因c-myc在骨髓、肝和脾內(nèi)表達升高，但未檢測到插入突變；(5)感染組雞只組織與血液中的VEGF及其受體基因隨著日齡的增加表達量也有一定程度的增加。
　　 根據(jù)九種腫瘤相關(guān)基因檢測結(jié)果，J亞群禽白血病腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、浸潤，可能與抑癌基因p53變異及高表達、抑癌基因p16失活及

11、p27的低表達、原癌基因c-myc激活、凋亡基因Bcl-2的過表達及VEGF基因和其受體基因(FLT1、Flk1/KDR)的過表達密切相關(guān)。
　　 本研究還據(jù)獲得的突變型p53基因和野生型p53基因，構(gòu)建了pEGFP-C1-p53和PCAGGS-p53真核表達載體，通過瞬時轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，經(jīng)間接免疫熒光、westernblot、共聚焦激光掃描顯微鏡觀察等檢測方法，證實兩種真核表達載體構(gòu)建成功，為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選和進