基于中醫(yī)異病同證理論探討輪狀病毒與HBGA的相關(guān)性研究.pdf

1、病毒性胃腸炎又稱病毒性腹瀉，是一組由多種病毒引起的急性腸道傳染病。目前研究表明輪狀病毒(Rotavirus，RV)、諾如病毒(Norovirus，NoV)是急性病毒性胃腸炎的最主要的兩種病原體，占到所有病原體的60％以上。盡管各種病原體的基因組結(jié)構(gòu)不盡相同，但它們所致胃腸炎的臨床表現(xiàn)基本類似，主要表現(xiàn)為:起病急、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉，排水樣便或稀便，也可有發(fā)熱及全身不適等癥狀。
　　因為RV和NoV是兩種不同的病原體，現(xiàn)代醫(yī)學通

2、常將RV和NoV胃腸炎分屬為兩種不同的疾病進行論述。由于兩者都具有嘔吐、腹瀉、發(fā)熱等相同的臨床癥狀和體征，RV和NoV胃腸炎應(yīng)同屬中醫(yī)“泄瀉”范疇，其病因病機之關(guān)鍵在于脾虛濕盛。證，是機體在疾病發(fā)展過程中的某一階段的病理概括，亦機體對病因作用的整體反應(yīng)狀態(tài)，反應(yīng)了疾病發(fā)展過程中某一階段病理變化的本質(zhì)。既然RV和NoV胃腸炎具有相同（或相似）的證，那么，RV與NoV感染是否存在著“異病同證”的物質(zhì)基礎(chǔ)呢？從組成人體的物質(zhì)分子方面分析引起證

3、的物質(zhì)基礎(chǔ)時，中醫(yī)證的本質(zhì)是一類具有信使分子性能的蛋白質(zhì)和肽類分子。從病毒感染人體的發(fā)病機制而言，細胞表面的特異性受體是病毒感染宿主細胞的決定因素之一?；诖?，本課題提出:RV和NoV胃腸炎“異病同證”的物質(zhì)基礎(chǔ)可能與相似的受體或共受體有關(guān)，即兩種病毒存在相同的受體或共受體。
　　由于NoV不能體外培養(yǎng)，亦無小動物模型，經(jīng)過近十余年來的志愿者攻擊試驗、分子流行病學和分子生物學實驗研究，現(xiàn)已基本確認腸道黏膜上的人類組織血型抗原(hu

4、man histo-blood group antigens，HBGA)是NoV的病毒受體。HBGA是紅細胞、呼吸道、泌尿生殖道和消化道粘膜上皮細胞表面的一類復雜的碳水化合物（以低聚糖、糖脂或者糖蛋白的形式存在），也可以自由寡聚糖的形式分泌在唾液、血液、母乳和腸道等體液中。在腸道上皮細胞上表現(xiàn)為ABH和Lewis抗原，對應(yīng)在紅細胞上表現(xiàn)為分泌型（A、B、O血型）和非分泌型。HBGA受體的發(fā)現(xiàn)成為NoV研究的里程碑，極大地推進了NoV與人

5、類宿主相互作用關(guān)系、病毒進化及免疫學機制等方面的研究。目前，RV的受體研究主要集中在細胞功能性蛋白上，初步認為Toll樣受體、整合素家族、神經(jīng)節(jié)苷脂、熱應(yīng)激同源蛋白(Hsc70)等都有一定的作用。近期有研究表明，RV感染與HBGA受體存在相關(guān)性。
　　本課題組在RV感染可能與HBGA相關(guān)的研究基礎(chǔ)上，提出“RV和NoV胃腸炎異病同證的物質(zhì)基礎(chǔ)可能與相似的受體或共受體有關(guān)”。首先，我們運用分子流行病學方法，收集臨床腹瀉患者的糞便標本

6、和配對唾液，以RV陰性和健康人群為對照，分析比較RV感染和HBGA相關(guān)性。同時，運用分子生物學實驗方法表達RV的衣殼蛋白VP8*，進行體外RV-VP8*與唾液HBGA的結(jié)合方式研究。
　　（一）輪狀病毒感染與HGBA相關(guān)性的流行病學研究
　　2013-2014年間在南方醫(yī)院兒科門診收集病毒性腹瀉患者糞便及配對唾液樣本，并以廣州某小學的健康人群唾液作為對照。糞便樣本通過trizol法行RNA提取，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后以cDNA為模板，行

7、PCR擴增RV-VP4區(qū)域以及NoVGⅠ型GⅡ型片段。RV陽性樣本進一步用分型引物進行分型，不能用分型引物分型者經(jīng)公司測序后結(jié)合NCBI BLAST功能以確定其基因型別。配對唾液的HBGA表型鑒定用ELISA方法，檢測的單抗包括A、B、H、Lewis a、Lewis b、Lewisx、Lewisy。其中，Lea-b+和/或Lex-y+為分泌型，Lea+b+和/或Le x+y+為部分分泌型，二者均歸入分泌型;Lea+b-和/或Lex+y-

8、為非分泌型。南方醫(yī)院配對樣本共266份，RV陽性樣本75份，配對唾液樣本中，檢出A型22份，B型17份，O型33份，AB型3份;Lea-b+/Lex-y+63份，Lea+b+/Lex+y+12份，Lea+b-/Lex+y-0份，分泌型75份，非分泌型0份。陰性樣本191份，剔除NoV陽性樣本40例后總樣本151份，檢出A型47份，B型44份，O型50份，AB型10份;Lewis狀態(tài)結(jié)果Lea-b+/Lex-y+132份，Lea+b+/L

9、ex+y+9份，Lea+b-/Lex+y-10份;分泌型141份，非分泌型10份。用SPSS20.0統(tǒng)計軟件，統(tǒng)計方法用x2檢驗，RV陽性與陰性之間的血型差異Pearson x2=3.047，自由度=3，P值=0.384(P＞0.05)，即RV陰陽性之間的血型差異沒有統(tǒng)計學意義。Lewis狀態(tài)用Fisher精確檢驗，x2=10.659，自由度=2，P值=0.004(P＜0.05)，Lewis狀態(tài)在RV感染與否中有顯著性差異，即Lewis

10、狀態(tài)對RV感染與否有影響。分泌型在RV感染與否中，P值=0.033(P＜0.05)，數(shù)據(jù)顯示分泌型在腹瀉患者中對RV感染與否有顯著性差異，RV感染與HBGA分泌型有關(guān)。
　　通過對健康人群159份唾液進行HBGA表型分析，結(jié)果表明，A型為35份，B型39份，O型79份，AB型6份; Lea-b+/Lex-y+134份，Lea+b+/Lex+y+5份，Lea+b-/Lex+y-20份;即分泌型139份(87.4％)，非分泌型20份(

11、12.6％)。RV陽性樣本HBGA狀態(tài)如前所述。用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對RV陽性和健康對照進行兩組間的x2檢驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組間的ABO血型差異Pearson卡方=1.546，P值=0.672(P＞0.05)，沒有統(tǒng)計學意義;兩組間的Lewis狀態(tài)經(jīng)Fisher精確檢驗，P值=0.000(P＜0.05)，存在顯著性差異。分泌型狀態(tài)經(jīng)Fisher精確檢驗，P=0.001(P＜0.05)，亦存在顯著性差異。結(jié)果充分表明:RV感染雖然與患者

12、的ABO血型狀態(tài)沒有明顯相關(guān)，但是與患者的分泌型狀態(tài)存在明顯的相關(guān)性，RV只感染分泌型患者，而不感染非分泌型患者。
　?。ǘ┹啝畈《綱P8*與唾液HBGA的結(jié)合方式研究
　　隨機選取選取3份輪狀病毒P[8]和3份P[4]陽性樣本，經(jīng)one-step RT-PCR試劑盒擴增VP4區(qū)域后，再行高保真酶擴增VP8*，將目的基因VP8*插入Pjet-2載體后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入top10后行質(zhì)粒提取。重組質(zhì)粒與pGEX-4T-1載體經(jīng)B

13、amHⅠ、SalⅠ雙酶切后切膠回收純化，線性載體pGEX-4T-1與目的片段VP8*連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞top10，經(jīng)菌落PCR或者菌落搖菌后質(zhì)粒提取行BamHⅠ和 SalⅠ雙酶切鑒定。對正確插入目的片段的質(zhì)粒pGEX-4T-1-VP8*再次轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞BL21，通過挑選菌落搖菌、擴大培養(yǎng)、離心、重懸、超聲破菌、離心以及與GST親和柱吸附等步驟進行蛋白表達。最后成功表達P[8]（GZ023株）和P[4](GZ705)株樣本GST-

14、VP8*蛋白。經(jīng)對洗脫蛋白進行SDS-PAGE分析，證實成功獲取所需的GST-VP8*融合蛋白。為后續(xù)研究VP8*與HBGA的結(jié)合模式奠定了實驗基礎(chǔ)。
　　輪狀病毒VP8*與唾液HBGA的結(jié)合方式采用ELISA法進行檢測。選取84份配體唾液進行體外結(jié)合實驗，其中分泌型A型22份、B型17份、O型33份，AB型3份，非分泌型(N)9份。根據(jù)梯度實驗結(jié)果，選取RV P[8]、P[4]GST-VP8*蛋白10μg/ml為最佳反應(yīng)濃度。實

15、驗結(jié)果表明:P[8] GST-VP8*結(jié)合分泌型HBGA的OD均值分別為A=1.082，B=0.486，AB=0.590，O=1.151，即其與HBGA的結(jié)合能力為O＞A＞AB＞B，而與非分泌型不結(jié)合。與其相類似，P[4]GST-VP8*結(jié)合分泌型HBGA的OD均值分別為A=0.348，B=0.157，AB=0.186，O=0.334，即其與HBGA結(jié)合能力為A＞O＞AB＞B，同樣的表現(xiàn)為與非分泌型不結(jié)合。就兩者而言，RV P[8]較P

16、[4]GST-VP8*蛋白結(jié)合HBGA能力強。該結(jié)果進一步闡明了RV感染與HBGA結(jié)合模式。P[8]、P[4]均能結(jié)合分泌型人群，且P[8]具有更強結(jié)合能力（分泌型人群占總?cè)巳?0％以上），這很好地解釋P[8]和P[4]能成為RV的主要流行株，而P[8]最為流行的原因。
　　綜合以上研究結(jié)果，我們首次在中國臨床人群中證實輪狀病毒感染與HBGA分泌型顯著相關(guān)，并通過建立體外RV GST-VP8*/HBGA結(jié)合模型，證實P[8]和P[