Synapsin I在丙烯酰胺致突觸可塑性損傷中的作用及 BDNF干預的實驗研究.pdf

1、目的：通過探討丙烯酰胺（acrylamide，ACR）對突觸素I（SynapsinI）蛋白表達的影響、對N-甲基馬來酰亞胺敏感因子（NSF）附著蛋白受體（SNARE）復合體結(jié)合/解離的影響和對SynapsinI上游磷酸化激酶的影響，明確ACR致神經(jīng)元突觸損傷對SynapsinI上下游蛋白調(diào)控的作用機制；通過對突觸損傷的神經(jīng)元進行腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的干預，進一步闡明BDNF對神經(jīng)元突觸損傷的保護作用。
　　方法：1、將N

2、B-1細胞通過二丁酰環(huán)腺苷酸（db-cAMP）誘導為成熟神經(jīng)元細胞后，MTT檢測ACR不同染毒濃度（0、25、50、100、150、200和250μg/ml）在不同染毒時間（24、48和72h）對 NB-1細胞相對存活率的影響；免疫印記（western blot）技術(shù)檢測Synapsin I磷酸化和非磷酸化蛋白表達，免疫共沉淀（Co-IP）試驗檢測神經(jīng)元突觸損傷前后SNARE復合體的結(jié)合/解離的變化，并使用Spearman對其進行相關(guān)性

3、分析；使用光鏡和電鏡分別檢測神經(jīng)元突觸損傷前后細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化；通過western blot技術(shù)分別檢測ACR染毒前后絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、環(huán)磷酸腺苷（PKA）和Ⅱ型鈣離子/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶（Ⅱ型 Ca2+/CaM激酶）蛋白表達變化。2、將誘導為成熟神經(jīng)元的NB-1細胞經(jīng)60μg/ml ACR染毒后給予不同濃度BDNF（50、75、100和125ng/ml）干預后通過MTT檢測細胞相對存活率；使用熒光定量PCR技術(shù)檢測BD

4、NF給予干預前后Synapsin I mRNA表達的變化，Co-IP試驗檢測BDNF給予干預前后SNARE復合體結(jié)合/解離的變化。
　　結(jié)果：10、25、50和100μg/ml的ACR染毒劑量染毒NB-1細胞48h后，隨著ACR染毒劑量的增加Synapsin I磷酸化和非磷酸化蛋白表達降低（P＜0.05）；隨著ACR染毒劑量的增加，SNARE復合體中突觸融合蛋白（syntaxin）和突觸小體相關(guān)蛋白（SNAP-25）逐漸解離；AC

5、R染毒損傷NB-1細胞后，SNARE復合體中syntaxin和SNAP-25結(jié)合狀態(tài)與Synapsin I、磷酸化Synapsin I（P-Synapsin I）蛋白表達呈正相關(guān)(Spearman相關(guān)系數(shù) r分別為0.897和0.935)，與 P-Synapsin I/Synapsin I差異性表達呈負相關(guān)(Spearman相關(guān)系數(shù)r為-0.250）；從電鏡圖可知，25μg/ml ACR染毒濃度下觀察到清亮球形突觸小泡和含有高電子密度的

6、致密顆粒的突觸小泡；50μg/ml ACR染毒濃度下觀察到含有高電子密度的致密顆粒的突觸小泡；ACR對NB-1細胞染毒48h后，在100μg/ml ACR染毒濃度下MAPK蛋白表達降低（P＜0.05），在25μg/ml ACR染毒濃度下PKA蛋白表達降低（P＜0.05），隨著ACR染毒劑量的增加，Ⅱ型Ca2+/CaM依賴蛋白激酶表達增加（P＜0.05）。2、熒光定量PCR試驗結(jié)果表明75ng/ml BDNF+60μg/ml ACR試驗組

7、與60μg/ml ACR試驗組相比，Synapsin I mRNA表達升高（P＜0.05）；Co-IP試驗結(jié)果表明BDNF干預前后SNARE復合體中兩個單體syntaxin和SNAP-25結(jié)合/解離狀態(tài)未發(fā)生變化。
　　結(jié)論：1、突觸內(nèi)特異性神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞和釋放可能與P-Synapsin I/Synapsin I差異性表達所調(diào)控的SNARE復合體的解離狀態(tài)導致的突觸功能損傷相關(guān)；ACR導致NB-1細胞神經(jīng)元突觸損傷后，Synaps