LW-AFC及其活性成分對(duì)皮質(zhì)酮致突觸可塑性損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、應(yīng)激是指當(dāng)機(jī)體受到各種內(nèi)外環(huán)境因素刺激時(shí)，所表現(xiàn)出的非特異性、全身性反應(yīng)，是以下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸激活為主的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)。適宜的應(yīng)激反應(yīng)有助于提高機(jī)體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，而過(guò)度的應(yīng)激則會(huì)引起 HPA軸的持續(xù)激活，從而誘導(dǎo)分泌過(guò)量的糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）。應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生疾病的主要原因之一正是體內(nèi)過(guò)高水平的糖皮質(zhì)激素水平。異常分泌的

2、GC與糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）結(jié)合，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降，谷氨酸釋放增加，產(chǎn)生興奮性毒性；GC也能夠直接導(dǎo)致海馬神經(jīng)元萎縮，突觸結(jié)構(gòu)和功能受損，影響突觸可塑性。
　　創(chuàng)新中藥六味地黃苷糖（LW-AFC）是由中醫(yī)“滋補(bǔ)腎陰”的經(jīng)典代表名方—六味地黃方分離得到的、由活性成分群組成的組分中藥，包含多糖（LWB-B）、糖苷（LWD-b）和寡糖（CA-30）三個(gè)活性成分群，已通過(guò)國(guó)家食品藥品監(jiān)督

3、管理總局批準(zhǔn)正在進(jìn)行 II期臨床試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)室前期已對(duì)LW-AFC的藥理作用和機(jī)制進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究，研究結(jié)果表明LW-AFC對(duì)阿爾茨海默癥（AD）樣認(rèn)知功能障礙、老化樣認(rèn)知功能障礙、多種急性應(yīng)激和皮質(zhì)酮（CORT）所致的學(xué)習(xí)記憶損傷具有明顯的改善作用，其作用與其調(diào)節(jié)機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)平衡密切相關(guān)。目前，LW-AFC的三個(gè)活性成分群及其主要活性成分對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性的作用和機(jī)制尚不十分清楚。因此，本課題擬采用急性外源性皮質(zhì)酮

4、皮下注射模型，以長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP）為突觸可塑性的代表性指標(biāo)，觀察LW-AFC及其活性成分對(duì)突觸可塑性的作用及機(jī)制。第一部分LW-AFC及其活性成分對(duì)皮質(zhì)酮致LTP損傷的保護(hù)作用研究1.LW-AFC對(duì)皮質(zhì)酮致LTP損傷的保護(hù)作用研究
　　皮下注射皮質(zhì)酮（CORT，50mg/kg）能夠顯著抑制高頻刺激后群峰電位的增強(qiáng)，表明CORT導(dǎo)致了LTP損傷。連續(xù)灌胃LW-AFC7天對(duì)CORT致LTP損傷具有明顯的保護(hù)作用，且在0.8-3.2g

5、/kg的劑量范圍內(nèi)具有劑量依賴(lài)性，而0.4g/kg的LW-AFC對(duì)LTP損傷明顯無(wú)保護(hù)作用。
　　2.活性成分群對(duì)皮質(zhì)酮致LTP損傷的作用研究
　　進(jìn)而觀察了LW-AFC的三個(gè)活性成分群LWB-B、LWD-b和CA-30對(duì)皮質(zhì)酮導(dǎo)致LTP損傷的影響，結(jié)果表明，與0.8g/kg LW-AFC劑量對(duì)應(yīng)的三個(gè)活性成分群（LWB-B0.16g/kg、LWD-b0.12g/kg和CA-300.52g/kg）中，僅CA-30對(duì)CORT所

6、致LTP損傷具有明顯保護(hù)作用，而LWB-B和LWD-b無(wú)明顯作用；當(dāng)LW-AFC劑量增加至1.6g/kg時(shí)，與之對(duì)應(yīng)的三個(gè)活性成分群（LWB-B0.32g/kg、LWD-b0.24g/kg和CA-301.04g/kg）均對(duì)CORT所致LTP損傷具有明顯保護(hù)作用。
　　依據(jù)上述結(jié)果，結(jié)合前期LW-AFC對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因模型小鼠和 SAMP8模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的最佳劑量，選取1.6 g/kg劑量的LW-AFC。
　　3.

7、主要活性成分對(duì)皮質(zhì)酮致LTP損傷的作用研究
　　進(jìn)一步選擇了LWD-b中的馬錢(qián)苷（LOG）、莫諾苷（MOR）和芍藥苷（PF）、CA-30中的水蘇糖（STA），觀察了其對(duì)皮質(zhì)酮致LTP損傷的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，連續(xù)灌胃LOG（50mg/kg）、MOR（50mg/kg）、PF（50mg/kg）和STA（450 mg/kg）7天均對(duì)CORT所致LTP損傷具有明顯保護(hù)作用。
　　本部分實(shí)驗(yàn)觀察了LW-AFC、三個(gè)活性成分群和主要的活性成

8、分對(duì) CORT致LTP損傷的保護(hù)作用，結(jié)果表明其均對(duì)CORT致LTP損傷具有顯著的保護(hù)作用。
　　第二部分LW-AFC活性成分對(duì)皮質(zhì)酮致LTP損傷的作用途徑研究
　　第一部分研究已經(jīng)證明，LW-AFC、三個(gè)活性成分群以及主要的活性成分均對(duì)CORT致LTP損傷具有明顯的保護(hù)作用。然而，其保護(hù)作用是直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，還是間接影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)尚不明確。因此，本部分研究采用不同給藥周期和給藥途徑的方式觀察LW-AFC活性成分的

9、作用異同。
　　1.不同給藥周期和途徑對(duì)LW-AFC活性成分作用的影響
　　首先，采用單次側(cè)腦室注射、灌胃和腹腔注射等給藥方式觀察了LW-AFC主要活性成分（LOG、MOR、PF和 STA）對(duì)CORT所致LTP損傷的影響。結(jié)果表明，單次給予LW-AFC活性成分均對(duì)LTP損傷無(wú)保護(hù)作用。
　　其次，采用多次灌胃和腹腔注射等給藥方式觀察了LW-AFC主要活性成分對(duì)CORT所致LTP損傷的影響。結(jié)果表明，多次給予LW-AFC

10、活性成分對(duì)LTP損傷具有顯著的保護(hù)作用。該結(jié)果提示，LW-AFC主要活性成分可能并非通過(guò)直接途徑影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，而是通過(guò)間接途徑發(fā)揮作用。
　　2.腸道菌群和免疫功能對(duì)LW-AFC活性成分作用的影響
　　首先，在多次給予STA實(shí)驗(yàn)中，灌胃STA對(duì)CORT所致的LTP具有明顯的保護(hù)作用，而腹腔注射STA無(wú)明顯作用，提示STA可能作用于腸道菌群而間接對(duì)LTP損傷發(fā)揮保護(hù)作用。
　　其次，采用組合抗生素抑制了機(jī)體的腸道

11、菌群，同時(shí)觀察LW-AFC及其主要活性成分對(duì)CORT致LTP損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，組合抗生素抑制了CA-30及STA對(duì)LTP損傷的保護(hù)作用，而對(duì)LWB-B、LWD-b及其活性成分的作用無(wú)明顯影響，進(jìn)一步提示CA-30和STA可能作用于腸道菌群而間接對(duì)LTP損傷發(fā)揮保護(hù)作用，且LW-AFC中三個(gè)活性成分群的作用途徑并不完全一致。
　　最后，采用環(huán)磷酰胺抑制了機(jī)體的免疫功能，同時(shí)觀察LW-AFC及其主要活性成分對(duì)CORT致LTP損

12、傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺抑制了LW-AFC對(duì)LTP損傷的保護(hù)作用，提示LW-AFC可能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能而間接對(duì)LTP損傷發(fā)揮作用。
　　綜上所述，該部分研究采用不同給藥周期和途徑的方式，觀察LW-AFC中主要的活性成分對(duì)CORT致LTP損傷的保護(hù)作用。結(jié)果提示，LW-AFC主要活性成分可能通過(guò)外周間接途徑對(duì)LTP損傷發(fā)揮保護(hù)作用。組合抗生素抑制了CA-30和STA的作用，提示CA-30和STA可能通過(guò)作用于腸道菌群發(fā)揮

13、對(duì)LTP損傷的保護(hù)作用。免疫抑制劑抑制了LW-AFC的作用，提示LW-AFC可能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能發(fā)揮對(duì)LTP損傷的保護(hù)作用。
　　第三部分LW-AFC及其活性成分對(duì)皮質(zhì)酮致LTP損傷的作用機(jī)制研究
　　1.LW-AFC及其活性成分對(duì)腸道菌群和腸道免疫功能的影響
　　結(jié)果表明，在門(mén)水平上，正常組小鼠腸道菌群主要以擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和藍(lán)藻菌門(mén)為主，而CORT模型組小鼠腸道菌群主要以擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和脫鐵桿菌門(mén)為主。C

14、ORT模型組與正常組比較，其中擬桿菌門(mén)水平降低，藍(lán)藻菌門(mén)水平降低至小于1％，而脫鐵桿菌門(mén)水平明顯升高，提示皮下注射皮質(zhì)酮誘導(dǎo)了腸道菌群結(jié)構(gòu)變化。
　　PCA聚類(lèi)分析結(jié)果表明正常組與CORT模型組小鼠之間的腸道菌群存在明顯差異，LW-AFC、CA-30和STA在一定程度上恢復(fù)了CORT所致的腸道菌群變化，而LWB-B、LWD-b及其活性成分對(duì)腸道菌群變化無(wú)影響。
　　CORT導(dǎo)致小鼠結(jié)腸分泌型免疫球蛋白（SIgA）水平呈下降趨

15、勢(shì)，但無(wú)顯著性差異。
　　2.LW-AFC及其活性成分對(duì)中樞氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響
　　結(jié)果顯示，CORT顯著誘導(dǎo)了谷氨酸（Glu）和γ-氨基丁酸（GABA）水平的升高，而對(duì)D-絲氨酸（D-ser）水平無(wú)顯著影響。
　　LW-AFC、CA-30和 STA能夠顯著降低 Glu水平，LWB-B、LWD-b和LOG具有降低 Glu水平的趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異。LW-AFC及其活性成分同樣具有低GABA水平的趨勢(shì)。LW-AFC能

16、夠顯著促進(jìn)D-ser水平的升高。
　　3.LW-AFC及其活性成分對(duì)D-ser代謝通路的影響
　　結(jié)果顯示，CORT顯著誘導(dǎo)了海馬組織中葡萄糖水平、3-磷酸甘油酸脫氫酶（PHGDH）、Na+依賴(lài)的丙氨酸-絲氨酸-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1（Asc-1）和囊泡相關(guān)蛋白2（VAMP2）蛋白表達(dá)水平的降低，以及絲氨酸消旋酶（SR）蛋白表達(dá)水平的升高。
　　LW-AFC及其活性成分能夠促進(jìn)葡萄糖水平、PHGDH、Asc-1和VAMP2

17、蛋白表達(dá)水平的升高，以及SR蛋白表達(dá)水平的降低。
　　綜上所述，在外周系統(tǒng)，CORT誘導(dǎo)了腸道菌群的變化；在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，CORT誘導(dǎo)Glu和GABA的大量積累，以及影響了NMDA受體輔助激動(dòng)D-ser的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌，導(dǎo)致 NMDA受體功能降低，進(jìn)而損傷突觸可塑性。LW-AFC、CA-30和STA能夠一定程度上恢復(fù)CORT導(dǎo)致的腸道菌群改變，具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用；LW-AFC及其部分活性成分能夠降低Glu水平、升高D-ser

18、水平，調(diào)節(jié)D-ser的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌，促進(jìn)了 NMDA受體功能，從而對(duì)CORT所致的LTP損傷發(fā)揮保護(hù)作用。
　　通過(guò)以上三部分研究，本論文研究主要得出以下結(jié)論：
　　1.單次給藥LW-AFC及其活性成分對(duì)皮質(zhì)酮致LTP損傷沒(méi)有明顯作用，多次給藥可明顯發(fā)揮對(duì)皮質(zhì)酮所致LTP損傷的保護(hù)作用，免疫抑制劑可阻斷其對(duì)LTP損傷的保護(hù)作用，提示LW-AFC及其活性成分是通過(guò)調(diào)節(jié)免疫功能間接發(fā)揮作用。
　　2.抗生素抑制腸道菌后

19、可明顯抑制CA-30對(duì)LTP的保護(hù)作用，但對(duì)其他活性成分無(wú)明顯影響，提示LW-AFC及其活性成分是通過(guò)腸道菌等不同途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。
　　3.調(diào)節(jié)中樞D-絲氨酸代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)等通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，進(jìn)而降低 NMDA受體功能是皮質(zhì)酮致LTP損傷的重要因素之一；LW-AFC及其活性成分可通過(guò)對(duì)D-絲氨酸代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)等通路的調(diào)節(jié)發(fā)揮其對(duì)皮質(zhì)酮致LTP損傷的保護(hù)作用。
　　本研究對(duì)于明確LW-AFC的物質(zhì)基礎(chǔ)、配伍研究及作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)