煙草中過表達(dá)番茄特異糖基轉(zhuǎn)移酶基因提高耐冷性.pdf

1、植物生長發(fā)育過程中經(jīng)常遭遇各種逆境脅迫，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)。植物通過一些基因的表達(dá)直接參與抗逆過程，或通過改變其他一些抗逆物質(zhì)的水平間接提高植物的抗逆性，像轉(zhuǎn)錄因子、糖基轉(zhuǎn)移酶基因等。糖基轉(zhuǎn)移酶通過糖基化各種代謝物的親水性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位、生物活性來間接發(fā)揮抗逆作用。因此，糖基轉(zhuǎn)移酶的功能越來越引起人們的注意。
　　 本研究從番茄葉片中克隆了特異糖基化油菜素內(nèi)酯的一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因（LeUGT73C5），并對(duì)該基因的表達(dá)

2、和低溫條件下轉(zhuǎn)基因煙草的功能進(jìn)行了分析。
　　 （1）利用NCBI提供的數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)全長引物，使用RT-PCR的方法從低溫處理的番茄葉片中克隆到LeUGT73C5基因的全長序列。該基因cDNA全長為1735bp，編碼494個(gè)氨基酸。進(jìn)化樹分析表明，LeUGT73C5與葡萄、蓖麻、毛果楊、水稻、擬南芥等植物的同一個(gè)基因具有高度的同源性，均含有保守序列PSPG盒。
　　 （2）將p35S-LeUGT73C5-GFP融合蛋白在擬南

3、芥原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)。通過Confocal觀察到GFP激發(fā)的綠色熒光和葉綠素的紅色自發(fā)熒光完全重合，說明LeLeUGT73C5基因產(chǎn)物定位于葉綠體。
　　 （3）Northern雜交分析表明，LeUGT73C5基因在植物體各個(gè)器官均有表達(dá)，但在葉片中表達(dá)量較高。同時(shí)該基因的表達(dá)受低溫、甲基紫精等誘導(dǎo)，其表達(dá)水平隨脅迫處理時(shí)間的延長而升高。
　　 （4）將獲得的LeUGT73C5基因與含有35S啟動(dòng)子的pBI121載體重組

4、，構(gòu)建了正義表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，用PCR及Northern雜交的方法對(duì)帶卡那抗性的轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)一步檢測(cè)，結(jié)果證明成功地獲得了轉(zhuǎn)正義基因的煙草植株。
　　 （5）構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-LeUGT73C5，并在大腸桿菌BL21中表達(dá)融合蛋白，將誘導(dǎo)帶切下，溶于PBS獲得抗原，免疫小白鼠。Western雜交表明，轉(zhuǎn)正義基因植株中LeUGT73C5基因已在蛋白水平上過表達(dá)。
　　 （6）正常生長條件

5、下，野生型與轉(zhuǎn)正義基因煙草植株生長量無明顯差別。但是，在低溫脅迫條件下，轉(zhuǎn)正義基因煙草植株比野生型表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐性，尤其是在恢復(fù)過程中。這表明過表達(dá)LeUGT73C5基因提高了煙草植株的抗逆能力。
　　 （7）在低溫弱光（4℃，100μmol m-2s-1）條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因株系的凈光合速率（Pn）和PSII最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）下降，但與野生型相比，轉(zhuǎn)正義基因株系的下降緩慢，這表明LeUGT73C5的過表達(dá)減輕了PS