小麥葉綠體轉基因技術研究與楊樹木質素合成相關糖基轉移酶基因克隆.pdf

1、本論文第一部分是有關小麥葉綠體轉基因技術。與核轉基因相比，葉綠體轉基因具有許多優(yōu)點，包括：外源基因高效表達、可以同時表達多個基因、安全性好、避免基因沉默現(xiàn)象和位置效應、可以直接表達原核基因、可以實現(xiàn)定位整合，后代遺傳穩(wěn)定等。葉綠體轉基因技術被看作是“環(huán)境友好型”的生物技術。迄今為止，葉綠體轉基因技術已成功應用于許多雙子葉及少數(shù)單子葉植物，例如：煙草、番茄、馬鈴薯、擬南芥、油菜、萵苣、矮牽牛花、水稻等。然而，作為世界重要糧食作物之一的小麥

2、，至今還未成功實現(xiàn)其葉綠體遺傳轉化，限制了該技術在小麥遺傳改良中的應用。
　　 制約該技術應用于單子葉禾本科農作物的主要原因有：在通過幼胚誘導的愈傷組織中，前質體尚未發(fā)育成綠色葉綠體，體積小，難以轉化；前質體基因表達調控與成熟葉綠體具有很大差別；禾本科作物葉片的反復再生較為困難，極大限制了葉綠體轉基因植株同質化。
　　 本實驗首次以小麥為材料，對小麥葉綠體轉基因前期組培技術以及同質化技術等關鍵技術進行研究，以期克服小麥組

3、培方法帶來的障礙，初步探索其葉綠體遺傳轉化，為今后小麥葉綠體基因工程育種打下基礎。論文在以下幾個方面取得了進展：
　　 1.建立了小麥葉綠體轉基因受體材料的誘導和繼代技術。對小麥幼胚愈傷組織培養(yǎng)體系進行研究，確定了濟南177(JN177)和中國春(CS)兩種小麥組織培養(yǎng)合適的接胚時間、繼代周期，明確了愈傷組織狀態(tài)與胚性的關系。幼胚的大小、狀態(tài)對于將來胚性愈傷組織的誘導及繼代十分重要，繼代過程中應盡量挑選黃色致密的胚性愈傷組織進行

4、繼代。在用小麥愈傷組織作為葉綠體轉基因的受體材料時，應盡量使用繼代培養(yǎng)1～6個月之內的愈傷組織，以保證較高的再生頻率。
　　 2.建立了小麥試管苗幼葉反復再生技術，為開展小麥葉綠體轉基因同質化研究奠定了重要的技術基礎。這是國內外首次通過再生苗葉片實現(xiàn)試管苗的二次再生。己申請國家發(fā)明專利(申請?zhí)?00910230815.8)。通過實驗比較發(fā)現(xiàn)，再生苗高度4cm左右時截取其葉片基部的l～2mm葉段進行愈傷組織誘導，愈傷組織誘導培養(yǎng)基

5、添加2mg/L2，4-D和lmg/L NAA，分化培養(yǎng)基添加10mg/L AgN03和lmg/LTIBA時兩種小麥具有最好的愈傷組織誘導率和二次再生率。
　　 3.初步建立了小麥愈傷組織的轉綠技術。經過特殊培養(yǎng)基的誘導培養(yǎng)，最終獲得了既具有胚性細胞特征又包含葉綠體的小麥綠色愈傷組織，這在國內外尚屬首次。獲得的綠色愈傷組織為開展小麥葉綠體轉基因提供了良好的受體材料。
　　 4.研究了轉化體的篩選技術。已經確定適用于小麥葉綠

6、體轉化體的篩選劑種類與濃度，建立了轉化體篩選的相關技術，發(fā)現(xiàn)100mg/L鏈霉素具有較好的再生苗篩選效果，而愈傷組織繼代篩選的最初濃度為200mg/L鏈霉素較合適。
　　 5.嘗試進行了小麥葉綠體的轉化。通過基因槍法對小麥愈傷組織進行葉綠體轉化，然后通過抗生素篩選，獲得了一定數(shù)量的抗性苗并移栽。
　　 本論文第二部分是木質素相關糖基轉移酶基因克隆。木質素是一類芳香族聚合物，是構成植物細胞壁的主要成分之一。目前，對其生物合

7、成途徑較為清楚，如改變合成途徑中的關鍵酶，就能改變木質素含量及H/G/S三種類型木質素之間的比例。
　　 木質素單體在細胞質內合成，但其聚合卻發(fā)生在細胞膜外，它們是如何跨膜運輸?shù)侥ね庵两袢狈ρ芯?。相關研究表明糖基轉移酶能改變其底物的跨膜運輸。最近在擬南芥中發(fā)現(xiàn)一個小的基因簇，其產物能糖基化木質素單體，這為木質素單體的跨膜運輸提供了一種假設。楊樹木質纖維是生物質能源工業(yè)和造紙業(yè)的重要原料，為了研究楊樹木質素合成調控機理，本論文首次