肝癌轉(zhuǎn)移特征性聚糖譜改變及相應(yīng)糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達差異研究.pdf

1、肝細胞肝癌(human hepatocellular carcinoma，HCC)在我國位居惡性腫瘤死亡率第二位，其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移一直是影響肝癌治療效果的重要因素。
　　 所有細胞都帶有致密而復(fù)雜的共價鍵結(jié)合的糖鏈(又叫做聚糖或寡糖)。聚糖結(jié)構(gòu)隨腫瘤進程不同會出現(xiàn)特征性的改變。尋找特征性改變的聚糖，弄清其改變的意義對于腫瘤的監(jiān)測、診治及預(yù)后判斷都具有重要價值。目前由于缺少高通量的糖分析技術(shù)，尋找腫瘤特征性聚糖改變的工作一直沒有系統(tǒng)性

2、的開展。凝集素芯片是2005年新出現(xiàn)的糖分析技術(shù)，可以高通量的解析樣本的聚糖信息。本研究首次采用凝集素芯片比較了3株肝細胞：L02(正常肝細胞系)、Hep3B(不轉(zhuǎn)移肝癌細胞系)、HCCLM3(高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞系)的細胞膜蛋白糖譜，篩選出Hep3B和HCCLM3細胞表面一系列和肝癌侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)特征性聚糖結(jié)構(gòu)，并且建立了糖基轉(zhuǎn)移酶基因芯片比較了Hep3B和HCCLM3的糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達譜，一方面用以解釋HCCLM3細胞表面特征性聚糖

3、結(jié)構(gòu)的發(fā)生，另一方面探討差異表達的糖基轉(zhuǎn)移酶所涉及的細胞功能及與HCCLM3細胞系轉(zhuǎn)移潛能的相關(guān)性。最后我們對其中一個差異表達的糖基轉(zhuǎn)移酶β3GalT5進行基因沉默，分析了這一基因的改變對高轉(zhuǎn)移肝癌細胞系HCCLM3的體外細胞行為學(xué)影響。
　　 第一部分、基于凝集素芯片的不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞系膜蛋白聚糖譜比較和特征性聚糖的篩選
　　 目的：本部分旨在評估凝集素芯片技術(shù)篩選復(fù)雜生物系統(tǒng)中聚糖譜改變的適用性，并以此為基礎(chǔ)篩選

4、可能和肝癌細胞系Hep3B、HCCLM3侵襲及轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)的特征性聚糖譜。
　　 方法：選取1對模式細胞：中華倉鼠卵巢細胞CHO和其N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ(N-acetylglucosaminyltransferaseⅠ)缺陷株Lecl，兩株細胞的膜蛋白具有已知的特征性的寡糖表達差異。采用Cy3標(biāo)記完整細胞膜，液氮速凍終止標(biāo)記后，Merk天然膜蛋白提取試劑盒提取細胞膜蛋白，免疫印跡法鑒定膜蛋白提取的純度，蛋白定量后每格凝集

5、素芯片圍欄10μg上樣，經(jīng)芯片孵育、清洗、掃描及統(tǒng)計分析后獲得細胞膜蛋白和凝集素結(jié)合譜，根據(jù)不同凝集素對聚糖的結(jié)合特異性，推斷膜蛋白聚糖譜，并比較不同細胞聚糖譜表達差異。前后3批制備的樣本及同一批樣本重復(fù)上樣，檢測芯片系統(tǒng)的重現(xiàn)性。隨后選取人肝細胞系：L02、Hep3B、HCCLM3如前述方法提取膜蛋白，熒光標(biāo)記，并進行凝集素芯片檢測，獲取不同肝細胞的細胞膜寡糖譜表達差異，并采用細胞表面凝集素組織化學(xué)技術(shù)驗證凝集素芯片結(jié)果。
　　

6、 結(jié)果：顯示凝集素芯片技術(shù)捕捉到細胞系CHO和Lecl的膜蛋白特征性寡糖表達差異，即Lecl由于缺少N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ，雜合型和復(fù)雜型聚糖表達減少，高甘露糖型聚糖代償性合成增多。
　　 比較L02、Hep3B的細胞膜糖譜，發(fā)現(xiàn)Hep3B對凝集素Cont、AAL、PHA-L、MPL的親和增強，對WGA親和減弱，提示細胞表面甘露糖，末端巖藻糖，β1-6分支聚糖及粘蛋白T抗原聚糖結(jié)構(gòu)增多而N-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)和/或多價唾液酸

7、結(jié)構(gòu)的減少。比較Hep3B和。HCCLM3的細胞膜聚糖譜，發(fā)現(xiàn)HCCLM3對凝集素。LCA、PHA-E、MAL-Ⅰ、MAL-Ⅱ、WGA的的親和增強，對RCA-Ⅰ親和減弱，提示細胞表面可能出現(xiàn)核心巖藻糖、平分型GlcNAc、α2-3連接唾液酸和/或N-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)表達增高以及末端β1-4連接半乳糖結(jié)構(gòu)表達減少。細胞表面凝集素組織化學(xué)驗證的結(jié)果和芯片結(jié)果一致，證明芯片結(jié)果是可靠的。經(jīng)過與文獻比較，這些發(fā)生改變的聚糖可能是肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)

8、的特征性聚糖。
　　 結(jié)論：本部分研究表明凝集素芯片技術(shù)是解析腫瘤相關(guān)病理過程中糖譜改變的適用工具，可用于尋找臨床腫瘤相關(guān)特征性糖譜，篩選用于腫瘤診斷的糖標(biāo)記；同時這一研究也為評價復(fù)雜生物系統(tǒng)中聚糖與生物學(xué)功能的關(guān)系提供了參考和技術(shù)平臺。
　　 第二部分、不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞系糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達譜比較及其與細胞膜聚糖譜的關(guān)系
　　 目的：本部分旨在比較不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞系糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達譜差異，從糖基轉(zhuǎn)移酶基

9、因水平的表達情況來解釋不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞膜蛋白糖譜差異表達情況，并探討表達改變的基因?qū)Ω伟┘毎缔D(zhuǎn)移行為的意義。
　　 方法：從功能糖組學(xué)網(wǎng)站http：//www.functionalglycomics.org數(shù)據(jù)庫篩選參與腫瘤相關(guān)聚糖合成的基因115個，其中包含90個糖基轉(zhuǎn)移酶，10個糖苷水解酶和5個糖核苷酸轉(zhuǎn)運子，合成探針點制糖基轉(zhuǎn)移酶基因芯片。芯片上同時設(shè)置陽性對照、陰性對照、點樣陽性對照以及外標(biāo)作為芯片質(zhì)控。選取人肝癌

10、細胞系Hep3B和HCCLM3，用Trizol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，經(jīng)熒光標(biāo)記后進行芯片雜交。選取差異倍數(shù)≧2或是≦0.5的基因，統(tǒng)計學(xué)方法分析差異顯著性，并經(jīng)生物信息學(xué)分析差異基因可能涉及的聚糖結(jié)構(gòu)合成通路及功能網(wǎng)絡(luò)。選取其中5個基因通過Real-time PCR方法驗證芯片結(jié)果。
　　 結(jié)果：人肝癌細胞系Hep3B和HCCLM3比較，18個基因在HCCLM3中表達上調(diào)，11個基因表達下調(diào)。表達改變的基因主要涉及N

11、-聚糖，O-聚糖粘蛋白sialyl Tn抗原、血型糖脂、紅細胞糖苷脂、sialyl lewis a(sLea)、sialyl lewis x(sLex)抗原合成。比對這兩株細胞的凝集素芯片親和譜與糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達譜，發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶基因FUT8、MGAT3、ST3Gal的上調(diào)分別對應(yīng)凝集素芯片上LCA、PHA-E、MA L-Ⅰ、Ⅱ親和信號增強。結(jié)合IPA工具分析差異基因涉及的功能網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)MGAT3、ST3Gals、β3GalT5、β

12、3Gn-Ts、FUT等基因通過改變對黏附分子或其受體的修飾和表達量來影響細胞的黏附；MGAT5等通過協(xié)同或獨立刺激血管生長因子分泌促進血管生成；MGAT5等基因也可以通過調(diào)節(jié)功能網(wǎng)絡(luò)中重要節(jié)點分子如TGF-β受體的表達，影響其后續(xù)的多種信號通路，參與細胞的凋亡增殖等。這些表達改變的基因可能通過調(diào)節(jié)細胞的黏附、血管生成及增殖凋亡共同影響HCCLM3的轉(zhuǎn)移行為。
　　 結(jié)論：本部分研究建立并比較了不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞系的糖基轉(zhuǎn)移酶

13、基因表達譜，一方面解釋了不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞表面特征性聚糖譜的發(fā)生；另一方面也為研究肝癌轉(zhuǎn)移的機制及尋找肝癌轉(zhuǎn)移干預(yù)靶點奠定基礎(chǔ)。
　　 第三部分、β3GalT5基因沉默對人高轉(zhuǎn)移肝癌細胞系的體外細胞行為學(xué)影響
　　 目的：本部分旨在通過RNA干擾技術(shù)研究糖基轉(zhuǎn)移酶β3GalT5(β1-3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶Ⅴ)在人高轉(zhuǎn)移肝癌細胞系HCCLM3中缺失和降低表達后對細胞增殖、凋亡、周期、黏附、侵襲、運動的影響。
　　 方

14、法：體外化學(xué)合成β3GalT5序列特異性雙鏈RNA(siRNA-β3GalT5)，與Lipofecta-mine2000結(jié)合后轉(zhuǎn)染細胞，采用Real-time PCR檢測β3GalT5基因水平表達，觀察siRNA-β3GalT5/Lipofectamine2000對β3GalT5表達的抑制作用。采用流式細胞儀測定細胞周期和凋亡，CCK-8試劑盒測定細胞增殖活力，細胞侵襲遷移實驗檢測細胞的侵襲遷移能力。
　　 結(jié)果：siRNA-β

15、3GalT5在濃度為80nM，干擾時間為48小時時可以獲得最高干擾效率81％。細胞行為學(xué)實驗表明β3GalT5基因沉默后對細胞的增殖、凋亡、細胞周期都沒有顯著影響，但細胞的黏附減少，細胞的侵襲運動能力減弱。由于β3GalT5是合成sLea結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵分子，可能是基因沉默后sLea合成減少，與黏附分子選凝素的結(jié)合減少，影響了HCCLM3細胞的黏附及侵襲遷移。而對于細胞增殖、凋亡、細胞周期，尚無報道顯示β3GalT5有直接或間接影響，可能β3

16、GalT5不是參與這些細胞行為的關(guān)鍵分子。
　　 結(jié)論：本部分研究表明β3GalT5的表達與人肝癌細胞系HCCLM3的黏附及侵襲運動能力成正相關(guān)，與細胞的增殖、凋亡、細胞周期無明顯相關(guān)性。干預(yù)β3GalT5的表達可能是干預(yù)肝癌轉(zhuǎn)移的潛在途徑。
　　 全文結(jié)論：
　　 1.凝集素芯片技術(shù)是解析腫瘤相關(guān)病理過程中糖譜改變的適用工具。
　　 2.與代表正常肝細胞的L02相比，甘露糖、末端巖藻糖、β1-6分支聚糖

17、及粘蛋白T抗原聚糖結(jié)構(gòu)的增多和N-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)和/或多價唾液酸結(jié)構(gòu)的減少是人肝癌細胞系Hep3B表面聚糖結(jié)構(gòu)的特征性改變，可能和肝癌生長侵襲相關(guān)。
　　 3.與不轉(zhuǎn)移人肝癌細胞系Hep3B相比，細胞表面核心巖藻糖、平分型GlcNAc、α2-3連接唾液酸結(jié)構(gòu)的增多是高轉(zhuǎn)移人肝癌細胞系HCCLM3特征性聚糖結(jié)構(gòu)，可能和肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)。糖基轉(zhuǎn)移酶基因FUT8、MGAT3、ST3Gal的表達上調(diào)是導(dǎo)致這些聚糖結(jié)構(gòu)改變的原因。
　　

18、 4.建立并比較了不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞系的糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達譜。差異表達的糖基轉(zhuǎn)移酶基因主要通過調(diào)節(jié)細胞的血管生成、黏附及凋亡影響細胞的轉(zhuǎn)移。
　　 5.β3GalT5的表達與人肝癌細胞系HCCLM3的黏附及侵襲運動能力成正相關(guān)，與細胞的增殖、凋亡、細胞周期無明顯相關(guān)性。
　　 潛在應(yīng)用價值：
　　 1.凝集素芯片技術(shù)可用于尋找臨床腫瘤特征性相關(guān)糖譜，篩選可用于腫瘤診斷的更好糖標(biāo)記。同時這一研究也為評價復(fù)雜生

19、物系統(tǒng)中聚糖與生物學(xué)功能的關(guān)系提供了參考和技術(shù)平臺。
　　 2.篩選出的Hep3B及HCCLM3細胞特征性聚糖結(jié)構(gòu)是潛在的肝癌侵襲及轉(zhuǎn)移糖標(biāo)記。
　　 3.肝癌細胞系Hep3B及HCCLM3的糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達譜為研究肝癌轉(zhuǎn)移的機制及尋找干預(yù)靶點提供了信息。
　　 4.干預(yù)β3GalT5的表達可能是干預(yù)肝癌轉(zhuǎn)移的潛在途徑。
　　 創(chuàng)新點：
　　 1.采用凝集素芯片技術(shù)系統(tǒng)篩選人肝癌細胞系侵襲及轉(zhuǎn)移