瑞香狼毒毒性物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、瑞香狼毒Stellera chamaejasme L.始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，一般取其根部入藥，味辛、性平、有毒，入肺、肝，有逐水祛痰，散結(jié)殺蟲的功效。目前關(guān)于瑞香狼毒中化學(xué)成分的諸多研究表明，瑞香狼毒含有多種黃酮類、木脂素類、二萜類、香豆素類等化學(xué)成分，而且隨著炮制方法的改變，瑞香狼毒中化學(xué)成分的含量及有效成分均發(fā)生著相應(yīng)的變化，導(dǎo)致其毒性程度也作出相應(yīng)改變。現(xiàn)代藥理研究學(xué)表明，瑞香狼毒的水提液、醇提液或者不同種的炮制品均表現(xiàn)出一定的抗

2、癌活性。然而在關(guān)于瑞香狼毒的毒性報(bào)道中，一部分是從植物毒性的角度來闡述瑞香狼毒的毒性作用，大多數(shù)是探索其不同極性部位的提取物對于動(dòng)物或體外細(xì)胞的毒性研究，究竟何種物質(zhì)產(chǎn)生動(dòng)物毒性鮮有研究，因此本課題將關(guān)于瑞香狼毒產(chǎn)生動(dòng)物毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。
　　1、利用HPLC-TOF/MS聯(lián)用技術(shù)，對瑞香狼毒各極性部位中的化學(xué)成分進(jìn)行鑒別分析。實(shí)驗(yàn)采用Agilent Poroshell120EC-C18色譜柱(2.1×100mm，

3、2.7μm)，0.1％甲酸水溶液-乙腈流動(dòng)相系統(tǒng)對樣品進(jìn)行梯度洗脫，采集ESI負(fù)離子模式下的質(zhì)譜信息，對照建立的化合物數(shù)據(jù)庫整合分析，最終鑒別得到瑞香狼毒總提物中的49種化學(xué)成分，石油醚提取物中的34種化學(xué)成分，乙酸乙酯提取物中的23種化學(xué)成分，正丁醇提取物中的23種化學(xué)成分，為下一步瑞香狼毒的毒性物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了一種快速高效的成分檢測方法。
　　2、對ICR小鼠進(jìn)行急性毒性灌胃實(shí)驗(yàn)，用以篩選瑞香狼毒毒性部位。分別提取瑞香狼毒的

4、不同極性部位，制備呈灌胃混懸液。在灌胃相同劑量（10g/kg）的不同極性部位提取物混懸藥液的情況下，乙酸乙酯組的小鼠存活率最低，證明了在相同劑量下的不同極性部位灌胃溶液中，乙酸乙酯毒性最強(qiáng)，初步可以確定瑞香狼毒的毒性部位在于乙酸乙酯部位。之后各組分別灌胃不同濃度的乙酸乙酯部位混懸液，連續(xù)觀察7d，詳細(xì)記錄小鼠死亡情況。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用PASW Statistics18.0軟件進(jìn)行Probit分析可得，瑞香狼毒乙酸乙酯提取物急性經(jīng)口毒性

5、的LD50為4.656g/kg。
　　3、采用柱層析技術(shù)與高效液相色譜制備等技術(shù)對瑞香狼毒乙酸乙酯部位進(jìn)行提取分離，得到單體化合物。通過使用高效液相-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)獲得單體化合物的詳細(xì)質(zhì)譜信息，同時(shí)結(jié)合高分辨核磁共振波譜結(jié)果，對提取分離到的單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。共確定了12種單體化合物的分子結(jié)構(gòu)，分別為表枇杷素(Epiafzelechin)、莨菪亭(Scopoletin)、異落葉松脂素(Isolariciresinol)、

6、鵝掌揪樹脂酚B(Lirioresinol B)、瑞香酚(Stelleranol)、西瑞香素(Daphnoretin)、狼毒色原酮(Chamaechromone)、新狼毒素A(Neochamaejasmin A)、狼毒素(Chamaejasmine)、異狼毒素(Isochamaej asmin)、7-甲氧基新狼毒素A(7-methoxyneochamaejasmin A)及羅漢松脂素(Matairesinol)。
　　4、采用血清藥

7、理學(xué)的方法，對小鼠灌胃毒性部位提取物中毒劑量后的血清移行成分及毒性靶器官中的成分進(jìn)行檢測?；诟咝б合嗌V串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀技術(shù)，建立一種對小鼠灌胃毒性部位中毒劑量后的血清移行成分及組織內(nèi)藥物原型的檢測方法，分別得到空白血漿與給藥后血漿的對比總離子流圖、空白組織與給藥后組織的對比總離子流圖，并根據(jù)扣除空白項(xiàng)之后找到各圖中的差異峰。為進(jìn)一步確定差異峰的化學(xué)成分，我們將之前提取得到的瑞香狼毒乙酸乙酯部位的單體化合物在相同色譜質(zhì)譜條件下進(jìn)樣分

8、析，通過比較各峰的保留時(shí)間及其質(zhì)譜信息，最終對血漿及組織中分布的毒性成分進(jìn)行定性，分別為表枇杷素、異狼毒素、狼毒素、狼毒色原酮、新狼毒素A以及瑞香酚六種化合物。通過對比等量組織中的原型成分含量，可以確定六種化合物在肝臟組織中分布最多最廣。
　　5、采用體外細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)對瑞香狼毒中的六種化合物進(jìn)行了正常肝細(xì)胞系L02的抑制率研究。通過使用MTT比色法得到化合物在不同濃度下對于正常肝細(xì)胞系L02的抑制率，對比相同給藥濃度下各化合物的細(xì)