基于微電極陣列與原子力顯微鏡聯(lián)合的細(xì)胞生理活動(dòng)多參數(shù)檢測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、電活動(dòng)和力學(xué)活動(dòng)在可興奮細(xì)胞如心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞的生理功能中扮演著重要角色。本文以心肌細(xì)胞為例來研究能夠同時(shí)記錄細(xì)胞電活動(dòng)和力學(xué)活動(dòng)的電機(jī)械信號(hào)檢測(cè)方法。在心肌細(xì)胞中，電生理活動(dòng)和力學(xué)活動(dòng)是緊密關(guān)聯(lián)的。心肌細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位的過程使胞內(nèi)鈣離子濃度迅速增大，鈣離子直接參與到心肌細(xì)胞的收縮活動(dòng)中。另外，心肌細(xì)胞的力學(xué)活動(dòng)對(duì)其電生理活動(dòng)具有反饋?zhàn)饔?。心肌?xì)胞的收縮張力會(huì)對(duì)肌絲的鈣離子敏感性以及細(xì)胞膜上的機(jī)械敏感性離子通道產(chǎn)生影響，從而影響心肌

2、細(xì)胞的電活動(dòng)。對(duì)心肌細(xì)胞的電活動(dòng)和力學(xué)活動(dòng)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)有助于了解心肌細(xì)胞在生理和病理狀態(tài)下的工作機(jī)制。
　　一方面，心肌細(xì)胞電機(jī)械活動(dòng)的檢測(cè)可以更全面地考察心血管藥物的作用效果，為藥物篩選提供一種高效的手段。細(xì)胞在藥物作用下的電生理活動(dòng)參數(shù)如電發(fā)放頻率和動(dòng)作電位時(shí)間長(zhǎng)度的變化已經(jīng)成為評(píng)價(jià)藥物作用的指標(biāo)。與此同時(shí)，心肌細(xì)胞的力學(xué)活動(dòng)參數(shù)如收縮力的大小和收縮——舒張周期的長(zhǎng)短也被用于藥效評(píng)價(jià)。對(duì)于一些藥物來說，在其濃度較低的情況下，心

3、肌細(xì)胞的電生理活動(dòng)變化不明顯而力學(xué)活動(dòng)則明顯增強(qiáng)。將細(xì)胞的電活動(dòng)檢測(cè)與力學(xué)測(cè)量相結(jié)合有助于提高藥效評(píng)估的準(zhǔn)確性和效率。
　　另一方面，心肌細(xì)胞的數(shù)學(xué)模型為深入理解心肌細(xì)胞的工作機(jī)制提供了有力工具，并且在虛擬教學(xué)、疾病治療效果的評(píng)價(jià)等方面有廣闊的應(yīng)用前景。較早發(fā)展起來的心肌細(xì)胞電生理模型主要在細(xì)胞膜離子學(xué)說基礎(chǔ)上描述心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的產(chǎn)生過程。另外，描述心肌細(xì)胞力學(xué)活動(dòng)的數(shù)學(xué)模型也被建立起來。以上兩種模型在心肌細(xì)胞研究中都具有重要價(jià)

4、值。然而，僅僅針對(duì)心肌細(xì)胞電活動(dòng)和力學(xué)活動(dòng)之一進(jìn)行建模不能完全反映心肌細(xì)胞的生理功能。為此，有研究者將上述兩種模型結(jié)合起來建立了心肌細(xì)胞的電機(jī)械模型。這種模型的建立和完善需要大量的同時(shí)包含細(xì)胞電學(xué)和力學(xué)信息的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，而細(xì)胞電機(jī)械信號(hào)檢測(cè)方法可以為數(shù)據(jù)采集過程提供支持。
　　由于以上兩方面的原因，發(fā)展一種高效的細(xì)胞電機(jī)械信號(hào)檢測(cè)方法是一項(xiàng)很有意義的工作。本文提出了一種結(jié)合微電極陣列電信號(hào)采集技術(shù)與原子力顯微鏡力學(xué)測(cè)量技術(shù)為一體的細(xì)

5、胞電機(jī)械信號(hào)檢測(cè)方法，并驗(yàn)證了該方法的有效性。本文的主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　(1)描述了細(xì)胞電活動(dòng)和力學(xué)活動(dòng)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，介紹了神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的產(chǎn)生過程和各自的特點(diǎn)，分析了心肌細(xì)胞的電力學(xué)耦合機(jī)制，最后闡述了細(xì)胞電機(jī)械信號(hào)檢測(cè)方法研究的意義和重要性。
　　(2)回顧了現(xiàn)有的細(xì)胞電生理信號(hào)和力學(xué)信號(hào)檢測(cè)技術(shù)，介紹了微電極陣列胞外電信號(hào)采集技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，另外還對(duì)原子力顯微鏡這一力學(xué)測(cè)量工具的原理、發(fā)展過程和生物

6、學(xué)應(yīng)用進(jìn)行了敘述。
　　(3)以神經(jīng)細(xì)胞為研究對(duì)象，利用微電極陣列對(duì)可控生長(zhǎng)的嗅球神經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行電信號(hào)采集。首先，制作了一種帶有微結(jié)構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)器件并對(duì)器件表面進(jìn)行改性處理。將嗅球神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)在該器件上，通過微結(jié)構(gòu)和器件表面特性來控制神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而形成具有固定連接方式的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的嗅球神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行了免疫化學(xué)鑒定。通過將細(xì)胞培養(yǎng)器件與微電極陣列相結(jié)合采集了網(wǎng)絡(luò)中神經(jīng)細(xì)胞的電信號(hào)。分析了實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)中存在的問題。

7、r>　　(4)采用原子力顯微鏡對(duì)神經(jīng)活動(dòng)誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行檢測(cè)。搭建了細(xì)胞力學(xué)檢測(cè)平臺(tái)。為了驗(yàn)證這一平臺(tái)在活細(xì)胞檢測(cè)中的可行性，以大鼠皮層神經(jīng)元的可塑性為考察對(duì)象，分析了以往研究中神經(jīng)細(xì)胞刺激方法和形態(tài)學(xué)檢測(cè)手段的不足，提出了將光解籠鎖刺激和原子力顯微鏡掃描成像結(jié)合起來檢測(cè)神經(jīng)活動(dòng)導(dǎo)致的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化這一方法。觀察了不同條件下解籠鎖藥物分子的作用區(qū)域隨時(shí)間的變化情況，確定了合適的刺激參數(shù)。分別對(duì)不同條件下的4組神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)試。對(duì)

8、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)過程的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了分析和討論。
　　(5)將微電極陣列與細(xì)胞力學(xué)測(cè)量平臺(tái)相結(jié)合，對(duì)心肌細(xì)胞的電機(jī)械活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)。介紹了心肌細(xì)胞電機(jī)械信號(hào)檢測(cè)的研究背景，描述了現(xiàn)有的細(xì)胞電機(jī)械信號(hào)檢測(cè)方法，分析了這些方法的不足，提出將微電極陣列與原子力顯微鏡相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方案。在微電極陣列芯片上培養(yǎng)心肌細(xì)胞。利用微電極陣列和原子力顯微鏡的聯(lián)合平臺(tái)，同時(shí)記錄了心肌細(xì)胞的電生理活動(dòng)和力學(xué)活動(dòng)。分析了心肌細(xì)胞電信號(hào)和力學(xué)信號(hào)的關(guān)聯(lián)。為了驗(yàn)證實(shí)

9、驗(yàn)平臺(tái)在藥物篩選中的有效性，記錄了心肌細(xì)胞在腎上腺素等藥物作用前后的電機(jī)械活動(dòng)。通過對(duì)細(xì)胞電發(fā)放間隔時(shí)間和橫向力大小的分析考察了藥物作用效果。測(cè)定了心肌細(xì)胞收縮力和刺激頻率關(guān)系曲線。討論了實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)過程的不足。
　　在本文提出的檢測(cè)平臺(tái)的基礎(chǔ)上，一些細(xì)胞生物學(xué)中的基本問題可以得到深入研究。多個(gè)心肌細(xì)胞如何通過力學(xué)或者電學(xué)信號(hào)的感知來實(shí)現(xiàn)一致的生理活動(dòng)節(jié)律是一個(gè)有趣的課題。通過AFM探針對(duì)心肌細(xì)胞施加特定大小的作用力并采用MEA

10、記錄細(xì)胞電生理信號(hào)，我們可以研究作用力的大小與細(xì)胞靜息電位、復(fù)極化時(shí)間之間的定量關(guān)系。利用AFM探針對(duì)心肌細(xì)胞施加頻率和大小可控的力學(xué)刺激，可以使細(xì)胞的生理活動(dòng)節(jié)律最終與力學(xué)刺激的頻率一致。在這個(gè)過程中，研究者可考察力學(xué)刺激幅值、作用的時(shí)間模式對(duì)生理活動(dòng)的影響。將心肌細(xì)胞培養(yǎng)在彈性模量不同的基底材料上，通過細(xì)胞電機(jī)械活動(dòng)的長(zhǎng)時(shí)間記錄來探究心肌細(xì)胞的力學(xué)環(huán)境對(duì)其特定基因表達(dá)、蛋白合成和收縮——舒張功能的影響。同樣，如果對(duì)心肌細(xì)胞施加持續(xù)的

11、變化的電場(chǎng)，我們同樣可以研究電場(chǎng)變化對(duì)心肌細(xì)胞生理活動(dòng)的影響。單純的心肌細(xì)胞培養(yǎng)體系和心肌細(xì)胞——成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)兩種體系中，細(xì)胞的電機(jī)械活動(dòng)特征（收縮頻率、收縮力大?。┦欠癫煌?，導(dǎo)致這些差異的分子機(jī)制也可以通過本文提出的細(xì)胞檢測(cè)平臺(tái)進(jìn)行探索。有研究表明心臟中間層細(xì)胞和心臟內(nèi)層細(xì)胞具有不同的生理特性，如果將心臟中不同部位的細(xì)胞準(zhǔn)確區(qū)分并分別進(jìn)行培養(yǎng)，利用細(xì)胞電機(jī)械測(cè)量平臺(tái)對(duì)這些細(xì)胞的電機(jī)械特性進(jìn)行定量表征，將所得數(shù)據(jù)用于心臟數(shù)學(xué)模型的構(gòu)

12、建，那么，這些模型對(duì)心臟在生理或者病理狀態(tài)下的活動(dòng)情況可能給出更精確的描述。利用本文提出的細(xì)胞電機(jī)械活動(dòng)檢測(cè)平臺(tái)，我們可以將細(xì)胞電學(xué)特性（細(xì)胞膜的電容、電阻等）測(cè)試和力學(xué)特性（彈性模量等）測(cè)試相結(jié)合，從而對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒別，為癌癥的診斷、治療和療效評(píng)估提供可能的途徑。
　　本文提出的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)具有對(duì)單個(gè)細(xì)胞同時(shí)施加力學(xué)、電學(xué)和生物化學(xué)刺激的能力。最近的研究表明機(jī)械刺激可以影響細(xì)胞微環(huán)境，誘導(dǎo)干細(xì)胞分化，影響細(xì)胞形態(tài)和肌動(dòng)蛋