米非司酮對子宮巨噬細胞活化的作用及機制研究.pdf

1、藥物避孕是婦女避孕史上的里程碑。自上世紀60年代以來，甾體激素類口服避孕藥(Oral contraceptives，OCs)，已在全球得到了廣泛的應(yīng)用。但是由于口服避孕藥含有雌激素，存在導(dǎo)致血栓性疾病、激素依賴性腫瘤及體重增加等副作用，限制了它的使用;而單純孕激素類避孕藥又由于存在不規(guī)則陰道流血及月經(jīng)周期控制欠佳等缺點，影響了它在臨床上的應(yīng)用。因此開發(fā)和研制新一代口服避孕藥，避免和減少上述的這些不良反應(yīng)迫在眉睫。米非司酮是一種具有強效的

2、抗孕激素受體和抗糖皮質(zhì)激素受體特性的合成19-去甲睪酮衍生物，自其合成以來在臨床上得到廣泛應(yīng)用，包括婦產(chǎn)科學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)及內(nèi)分泌學(xué)等。目前，米非司酮也是一種在無保護性生活之后、高效的緊急避孕方法，并且已經(jīng)有研究認為其有潛力成為新型的、副作用極少的長期口服避孕藥;研究已經(jīng)表明米非司酮并不直接對胚胎產(chǎn)生不利影響，但可通過作用于內(nèi)膜來防止胚胎種植而又不影響排卵，從而實現(xiàn)“內(nèi)膜避孕”。但是，米非司酮避孕的確切作用機制仍有待進一步闡明。巨噬細

3、胞是可塑性最強的免疫細胞，存在于所有組織中，并且可以根據(jù)它們所處微環(huán)境的變化而改變其功能。由于在人類的子宮內(nèi)膜中幾乎沒有樹突狀細胞，巨噬細胞就成為了最主要的抗原呈遞細胞。子宮巨噬細胞可能在胚胎成功植入所需的幾個過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括子宮內(nèi)膜的重塑、相鄰免疫細胞的免疫調(diào)節(jié)、滋養(yǎng)細胞侵襲和胎兒-母體免疫耐受的調(diào)節(jié)等。深入認識和探索米非司酮確切的避孕機理可能為新型避孕藥的開發(fā)和研制提供科學(xué)依據(jù)。
　　第一部分子宮巨噬細胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下為

4、M2型巨噬細胞
　　目的:
　　明確子宮巨噬細胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下的活化表型。
　　方法:
　　從早孕期婦女外周血分離單核細胞，體外分別誘導(dǎo)分化成經(jīng)典活化(M1)型巨噬細胞及替代活化(M2)型巨噬細胞;同時從早孕期蛻膜組織分離、培養(yǎng)得到高純度的子宮巨噬細胞，在顯微鏡下觀察子宮巨噬細胞的形態(tài)，采用流式細胞術(shù)檢測子宮巨噬細胞的CD14+表面標記。采用ELISA檢測子宮巨噬細胞培養(yǎng)的上清液中的細胞因子IL-12p70、IL-

5、23、 IL-p40及IL-10的表達水平，將其分別與M1型巨噬細胞及M2型巨噬細胞分泌的相應(yīng)的細胞因子相比較。
　　結(jié)果:
　　在本研究中，我們采用免疫磁珠分選法成功分離到了高純度的子宮巨噬細胞（90％以上）;與M1型巨噬細胞相比，子宮巨噬細胞分泌的抗炎因子IL-10水平明顯更高，表達的促炎因子IL-12p70、IL-23和IL-p40水平明顯低下，而子宮巨噬細胞與M2巨噬細胞表達的細胞因子相似，即高IL-10水平和低IL

6、-12p70，IL-23和IL-p40水平。
　　結(jié)論:
　　子宮巨噬細胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下呈現(xiàn)M2表型，這可能有利于胚胎種植及妊娠的發(fā)展。
　　第二部分米非司酮通過糖皮質(zhì)激素受體拮抗作用促進M1型巨噬細胞活化
　　目的:
　　明確米非司酮對子宮巨噬細胞活化的作用及途徑。
　　方法:
　　將體外分選到的高純度子宮巨噬細胞采用不同濃度的米非司酮、米非司酮+孕酮、米非司酮+地塞米松進行處理。采用ELISA

7、檢測米非司酮、米非司酮+孕酮、米非司酮+地塞米松對子宮巨噬細胞活化的影響。采用MTT檢測米非司酮對子宮巨噬細胞活力的影響。
　　結(jié)果:
　　與未處理的子宮巨噬細胞相比，經(jīng)低劑量米非司酮處理的子宮巨噬細胞產(chǎn)生的IL-12p70、IL-23和IL-p40明顯增加，而IL-10的表達水平卻明顯降低;并且與經(jīng)65nmol/L米非司酮處理的子宮巨噬細胞相比，經(jīng)200 nmol/L米非司酮處理的子宮巨噬細胞明顯產(chǎn)生更多的IL-12p70

8、、IL-23和IL-12p40，而抑制IL-10產(chǎn)生的作用更加明顯。經(jīng)低劑量米非司酮處理的巨噬細胞與未經(jīng)處理的巨噬細胞之間的細胞活力沒有顯著性差異。與經(jīng)200nmol/L米非司酮處理的巨噬細胞相比，孕酮對200nmol/L米非司酮誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生的高IL-12p70、IL-23、IL-p40表達沒有影響，而且不影響200nmol/L米非司酮對巨噬細胞IL-10表達的抑制。地塞米松能明顯抑制200nmol/L米非司酮誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生的IL

9、-12p70、IL-23和IL-12p40的表達水平，同時能逆轉(zhuǎn)200nmol/L米非司酮對巨噬細胞IL-10表達的抑制。
　　結(jié)論:
　　米非司酮通過糖皮質(zhì)激素受體拮抗作用促進子宮巨噬細胞從M2型向M1型轉(zhuǎn)化，從而有可能增強Th1免疫應(yīng)答而抑制Th2免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致胚胎植入失敗，這可能是其避孕機理之一。
　　第三部分米非司酮通過激活TAK1促進M1型巨噬細胞活化
　　目的:
　　明確米非司酮對子宮巨噬細

10、胞活化的分子機制。
　　方法:
　　將體外分選到的高純度子宮巨噬細胞采用200 nmol/L米非司酮、200 nmol/L米非司酮和6umol/L地塞米松進行處理。采用蛋白免疫印跡法檢測NFκβ、p38MAPK、ERK、JNK及TAK1蛋白磷酸化水平的變化。分別采用NFκβ、p38 MAPK及TAK1特異性抑制劑JSH-23、SB203580及5Z-7-oxozeaenol檢測其對米非司酮介導(dǎo)的M1型巨噬細胞活化的影響。

11、r>　　結(jié)果:
　　經(jīng)200nmol/L米非司酮處理的子宮巨噬細胞Iκβα的磷酸化明顯增加，6umol/L地塞米松能明顯抑制這一作用。與抑制米非司酮介導(dǎo)Iκβα磷酸化一致，地塞米松也能抑制米非司酮介導(dǎo)的Iκβa降解。另外，地塞米松抑制了米非司酮介導(dǎo)的磷酸化p65的細胞內(nèi)核轉(zhuǎn)位。經(jīng)200nmol/L米非司酮處理的子宮巨噬細胞p38 MAPK的磷酸化明顯增加，地塞米松能明顯抑制這一作用。JSH-23能明顯抑制米非司酮誘導(dǎo)的IL-12p

12、70、IL-23和IL-12p40的表達水平，但是JSH-23并不能增加IL-10的表達水平。SB203580抑制p38MAPK激活后對米非司酮誘導(dǎo)的經(jīng)典巨噬細胞活化沒有影響。經(jīng)200nmol/L米非司酮處理的子宮巨噬細胞TAK1的磷酸化明顯增加，地塞米松能明顯抑制這一作用。5Z-7-oxozeaenol能明顯抑制米非司酮誘導(dǎo)的NFκβ活化，并且明顯抑制IL-12p70、IL-23和IL-12p40的產(chǎn)生，同時能明顯增加IL-10的表達