米非司酮對樹突狀細(xì)胞分化和功能的調(diào)節(jié)及機(jī)制研究.pdf

1、米非司酮是一種人工合成的19-去甲基睪酮衍生物，具有抗孕激素和糖皮質(zhì)激素作用。從首次合成米非司酮以來，米非司酮已被廣泛用作抗早孕治療，并成功用于緊急避孕。多年來的基礎(chǔ)和臨床研究表明，米非司酮在婦產(chǎn)科學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、腫瘤學(xué)及免疫學(xué)等多個領(lǐng)域表現(xiàn)出一定的應(yīng)用潛力。米非司酮作為孕激素受體調(diào)節(jié)劑，是目前藥物流產(chǎn)的常規(guī)用藥。近年的研究表明，低劑量的米非司酮具有“內(nèi)膜避孕”作用，然而其作用的免疫學(xué)機(jī)制卻并不清楚。
　　樹突狀細(xì)胞(dendrit

2、ic cells，DCs)是目前已知的機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職性抗原提呈細(xì)胞。吲哚胺2，3-雙加氧酶(indoleamine2，3-dioxygenase，IDO)是細(xì)胞內(nèi)的一種催化色氨酸分子沿犬尿酸途徑進(jìn)行分解代謝的限速酶。IDO主要表達(dá)在樹突狀細(xì)胞，在維持早期妊娠中發(fā)揮重要作用。IDO+DC能夠抑制T細(xì)胞活化與增殖，促進(jìn)T細(xì)胞的凋亡，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生。
　　因此，在本研究中我們選用外周血樹突狀細(xì)胞為研究對象，就上述疑問探討

3、米非司酮對樹突狀細(xì)胞分化和功能的調(diào)節(jié)及其可能的作用機(jī)制。在本研究結(jié)合體外實驗，從細(xì)胞水平，利用Western blot、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、Real-timeRT-PCR及流式細(xì)胞檢測等相關(guān)技術(shù)，探討米非司酮在胚胎植入過程中對母胎界面獲得性免疫的調(diào)節(jié)及機(jī)理，為新避孕途徑的開發(fā)以及人類的生殖過程中相關(guān)疾病發(fā)生機(jī)理和治療研究提供新的思路。
　　第一部分米非司酮對DCs誘導(dǎo)分化的調(diào)節(jié)作用
　　目的:
　　分選外周

4、血樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)，以20 nmol/L，65nmol/L，200nmol/L米非司酮(Mifepristone，Ru486)分別作用于DCs，觀察米非司酮對DCs成熟及生物學(xué)功能的影響，探討米非司酮在胚胎植入過程中對母胎界面獲得性免疫的調(diào)節(jié)及機(jī)理。
　　方法:
　　人外周血CDl4+單核細(xì)胞在體外經(jīng)GM-CSF、IL-4培養(yǎng)6天誘導(dǎo)分化為未成熟DCs。加入不同劑量的米非司酮(20 nmo

5、l/L，65 nmol/L，200 nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)48小時，同時設(shè)置溶劑對照組(加入米非司酮溶劑dimethyl sulphoxide，DMSO)。流式細(xì)胞儀檢測和分析細(xì)胞表面CD80、CD86和ICAM-Ⅰ分子的表達(dá)情況。酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbnent assay,ELISA)檢測DCs培養(yǎng)上清液中IL-12p70水平。
　　結(jié)果:
　　1.米非司酮上調(diào)DCs表面CD80

6、及CD86和ICAM-Ⅰ分子表達(dá)。
　　2.與對照組相比，米非司酮處理組DCs分泌的IL-12p70水平顯著升高(P＜0.05)。在一定范圍內(nèi)(65 nmol/L～200 nmol/L)，米非司酮促進(jìn)DCs分泌IL-12p70的能力隨著米非司酮濃度增大而增強(qiáng)。
　　結(jié)論:
　　1.米非司酮誘導(dǎo)DCs表型成熟，促進(jìn)DCs分泌IL-12。
　　2.在一定濃度范圍內(nèi)，米非司酮對DCs的促成熟作用存在量效關(guān)系。
　

7、　3.米非司酮可能通過促進(jìn)DCs成熟，引發(fā)母體對半同種異體胎兒抗原免疫排斥，達(dá)到抗著床避孕。
　　關(guān)鍵詞:樹突狀細(xì)胞;米非司酮;成熟;內(nèi)膜避孕
　　第二部分米非司酮在DCs對獲得性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中的作用
　　目的:
　　通過檢測DCs對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatoryT cells，Tregs)Foxp3表達(dá)和IL-10分泌的影響，研究米非司酮在DCs對獲得性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中的作用。
　　方法

8、:
　　將不同劑量米非司酮處理后DCs分別與Tregs混合培養(yǎng)，蛋白印跡法(Westernblot)檢測forkhead box p3(FOXP3)的表達(dá)，ELISA檢測混合培養(yǎng)上清中IL-10的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　未成熟DCs分別經(jīng)20，65，200nM米非司酮，DMSO溶劑處理后用作刺激細(xì)胞，同種異體Tregs用作反應(yīng)細(xì)胞。采用Western blot檢測FOXP3蛋白水平。我們發(fā)現(xiàn)，200nmol/L米非司酮

9、組，F(xiàn)OXP3蛋白表達(dá)較對照組低(0.25±0.03 vs.0.62±0.01;P＜.01)，也較65 nmol/L米非司酮組低(0.25±0.03 vs.0.34±0.01;P＜.01)。對照組和20 nmol/L米非司酮組間沒有明顯差異。
　　同時，我們采用ELISA檢測上清液中IL-10的表達(dá)。65 nmol/L和200nmol/L組IL-10表達(dá)降低，IL-10的變化和FOXP3蛋白水平的變化是一致的。IL-10表達(dá)在對照

10、組，20nmol/L米非司酮組，65nmol/L米非司酮組和200nmol/L米非司酮組分別為:171.25±7.85，158.34±9.46，127.36±6.37和109.2±9.45。
　　結(jié)論:
　　經(jīng)米非司酮處理后的DCs抑制Tregs表達(dá)FOXP3和IL-10。這提示米非司酮在DCs對獲得性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。
　　關(guān)鍵詞:樹突狀細(xì)胞;米非司酮;Foxp3;IL-10;內(nèi)膜避孕
　　第三部

11、分 IDO在米非司酮影響DCs功能中的作用
　　目的:
　　1.通過檢測米非司酮對吲哚胺-2，3-雙加氧酶(Indoleamine2，3-dioxygenase，IDO)表達(dá)及其活性的影響。
　　2.探討IDO在米非司酮影響DCs功能中的作用。
　　方法:
　　1.人外周血CDl4+單核細(xì)胞在體外經(jīng)GM-CSF、IL-4培養(yǎng)6天誘導(dǎo)分化為未成熟DCs。加入不同劑量的米非司酮(20 nmol/L，65 nmo

12、l/L，200 nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)48小時，同時設(shè)置溶劑對照組(加入米非司酮溶劑DMSO)。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測IDO mRNA的表達(dá);Western blot檢測IDO蛋白的表達(dá);高效液相色譜法(HPLC)檢測色氨酸(Trp)及其特異代謝產(chǎn)物犬尿氨酸(Kyn)的濃度，以判斷IDO活性。
　　2.人外周血CDl4+單核細(xì)胞在體外經(jīng)GM-CSF、IL-4培養(yǎng)6天誘導(dǎo)分化為未成熟DCs。加入200 nmol/L繼

13、續(xù)培養(yǎng)48小時，將培養(yǎng)后的成熟DCs分為2組:加入1 ng/ml1-甲基-色氨酸(1-methyl tryptophan，1-MT)培養(yǎng)者為組2，未加入1ng/ml1-MT者為組1，每組1.0×106/ml DCs。加入1-MT10小時后，和Tregs(1.0×105/ml)在6孔板中混合培養(yǎng)5天。western-blotthe檢測foxp3蛋白的表達(dá);ELISA檢測上清中IL-10的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、米非司酮處理

14、后的DCs的DO的表達(dá)和活性
　　采用Real-time RT-PCR檢測IDO mRNA在DCs的表達(dá)。IDOmRNA表達(dá)在對照組，20nmol/L米非司酮組，65nmol/L米非司酮組和200nmol/L米非司酮組分別為:1，0.86±0.12，0.69±0.08和0.52±0.05。IDO mRNA在樹突狀細(xì)胞的表達(dá)在65和200 nmol/L米非司酮組較對照組低(P＜.01）。65和200nmol/L組間下調(diào)IDO呈劑量依

15、賴性(P＜.05)。對照組和20 nmol/L米非司酮組間沒有明顯差異(P＞.05）。
　　采用Western blot檢測IDO蛋白水平和采用Real-time RT-PCR檢測的IDOmRNA水平是一致的。IDO蛋白表達(dá)在對照組，20nmol/L米非司酮組，65nmol/L米非司酮組和200nmol/L米非司酮組分別為:0.94±0.10，0.75±0.11，0.67±0.07和0.42±0.23。
　　為了評價IDO活

16、性，我們用高效液相色譜法檢測Kyn/Trp比例。Kyn/Trp比例水平和IDO mRNA和蛋白水平一致。IDO活性在20nmol/L米非司酮組，65nmol/L米非司酮組和200nmol/L米非司酮組分別為1.39±0.03，0.62±0.01，0.12±0.02，對照組為1.42±0.03。
　　2、IDO抑制劑1-MT處理后FOXP3和IL-10的表達(dá)
　　加入1-MT后，IDO作用受抑制，F(xiàn)OXP3表達(dá)升高(0.12±

17、0.01vs.2.21±0.16.P＜0.01); Tregs分泌IL-10升高(106.47±11.58 vs.327.01±15.95P＜0.01)。
　　結(jié)論
　　米非司酮降低DCs中IDOmRNA及蛋白的表達(dá)，降低IDO酶活性;IDO抑制劑1-MT可逆轉(zhuǎn)米非司酮處理后的DCs抑制Tregs表達(dá)FOXP3和IL-10，提示低劑量米非司酮通過降低IDO調(diào)節(jié)DCs功能。這可能是米非司酮避孕的免疫學(xué)機(jī)制。
　　關(guān)鍵詞: