uPA-PAI-1在非酒精性脂肪性肝纖維化進(jìn)展中作用及機(jī)制的研究.pdf

1、目的：非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷。隨著人們膳食結(jié)構(gòu)及生活方式的改變，全球NAFLD患病率呈現(xiàn)上升趨勢，其疾病譜包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎/肝纖維化、肝硬化、肝細(xì)胞癌。非酒精性脂肪性肝纖維化是疾病進(jìn)展至肝硬化、肝癌和終末期肝病必經(jīng)的病理階段，肝纖維化病變能否控制或逆轉(zhuǎn)在很大程度上影響患者的預(yù)后。目前臨床缺乏高效、無明

2、顯毒副作用的抗肝纖維化西藥，中藥因其多組分、多途徑、多靶點(diǎn)抗肝纖維化作用而日益引起學(xué)者關(guān)注。已有研究表明，丹參、桃仁、絞股蘭等中藥均有一定的抗肝纖維作用，由以上三味中藥為主組成的扶正化瘀復(fù)方具有良好的抗慢性乙型肝炎肝纖維化的作用，但該中藥復(fù)方對非酒精性脂肪性肝纖維化的作用及作用機(jī)制尚不明確。uPA/PAI-1是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要酶系，它們的表達(dá)失衡直接影響細(xì)胞外基質(zhì)沉積，進(jìn)而影響肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。本研究以蛋氨酸-膽堿缺乏(me

3、thionine andcholine deficient，MCD)飲食建立小鼠非酒精性脂肪性肝纖維化模型，扶正化瘀復(fù)方或聯(lián)合血紅素氧化酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)激動劑、抑制劑進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，旨在探明uPA/PAI-1在非酒精性脂肪性肝纖維化進(jìn)展中的作用及扶正化瘀復(fù)方和/或HO-1激動劑對uPA/PAI-1表達(dá)的影響及作用機(jī)制。
　　方法：選用清潔級8周齡健康雄性C57BL/6J小鼠(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物

4、研究所)，所有小鼠普通飼料喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為7組，以MCD飲食喂養(yǎng)8周建立非酒精性脂肪性肝纖維化模型，同時分別應(yīng)用扶正化瘀復(fù)方、HO-1激動劑血晶素、抑制劑鋅原卟啉、扶正化瘀復(fù)方聯(lián)合HO-1激動劑或抑制劑進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，以蛋氨酸-膽堿充足飲食設(shè)立對照組。喂養(yǎng)8周造模結(jié)束后，深度麻醉下取血，4℃離心分離血清，留取部分肝組織以4％中性甲醛固定，備做病理切片，其余肝組織用液氮快速冷凍后置于-80℃冰箱保存，備提取蛋白、mRNA。
　　1.

5、觀察實(shí)驗(yàn)小鼠一般情況：處死小鼠前觀察其精神狀態(tài)、毛發(fā)，并稱量體重及肝濕重，計算肝指數(shù)(肝濕重/體重×100％)。
　　2.血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)采用日本Olympus AU5400全自動生化分析儀酶法測定。
　　3.肝組織切片采用蘇木精-伊紅(haematoxylin and eosi

6、n，HE)染色觀察肝細(xì)胞脂肪變、炎癥程度；Masson染色觀察肝纖維化程度。
　　4.肝組織纖維化相關(guān)基因檢測：采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription polymerase chain reaction，RT-PCR)、Western blot及免疫組織化學(xué)檢測肝組織HO-1、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta1，TGF-β1)、尿激酶型纖溶酶原激活物(uro

7、kinase type plasminogen activator，uPA)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

8、采用SPSS13.0單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較采用Student-Newman-Keuls分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)驗(yàn)動物一般情況：對照組小鼠活潑、毛發(fā)有光澤，體重、肝濕重隨造模時間延長逐漸增加。各干預(yù)組小鼠精神差，體重、肝濕重均顯著低于對照組，尤以HO-1抑制劑組下降最為明顯(P值均<0.05)，但各干預(yù)組小鼠體重及肝濕重之間無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。各組實(shí)驗(yàn)小鼠肝指數(shù)亦無顯著統(tǒng)計學(xué)

9、差異(P>0.05)。
　　2.血清ALT、AST水平：血清ALT和AST水平依次為：對照組<扶正化瘀復(fù)方聯(lián)合HO-1激動劑組<扶正化瘀復(fù)方組　　3.肝組織病理學(xué)變化：對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝板走行整齊；模型組小鼠肝組織出現(xiàn)中至重度肝細(xì)胞脂肪變性，呈現(xiàn)大泡性為主的脂肪變，以腺泡3帶為著，伴有點(diǎn)、灶狀

10、肝細(xì)胞壞死、炎細(xì)胞浸潤、輕度匯管區(qū)纖維組織增生及竇周纖維化；HO-1激動劑組、扶正化瘀復(fù)方組及扶正化瘀復(fù)方聯(lián)合HO-1激動劑組肝細(xì)胞脂肪變及炎癥活動度較模型組均明顯減輕，尤以扶正化瘀復(fù)方聯(lián)合HO-1激動劑組改善顯著；HO-1抑制劑組肝組織炎癥及纖維化程度較模型組加重，扶正化瘀復(fù)方聯(lián)合HO-1抑制劑組肝細(xì)胞脂肪變及炎癥程度較HO-1抑制劑組減輕。
　　4.肝組織HO-1、TGF-β1、uPA、PAI-1、MMP-9和TIMP-1 m

11、RNA及蛋白表達(dá)情況：伴隨血清ALT、AST水平升高，模型組肝組織纖維化相關(guān)基因TGF-β1、PAI-1、uPA、MMP-9、TIMP-1及HO-1 mRNA表達(dá)較對照組顯著升高。扶正化瘀復(fù)方組HO-1、TGF-β1、PAI-1、TIMP-1 mRNA及蛋白表達(dá)量較模型組顯著降低(P<0.05)，而uPA、MMP-9表達(dá)量呈相反趨勢(P<0.05)；扶正化瘀復(fù)方聯(lián)合HO-1激動劑組伴隨HO-1 mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，PAI-1、TGF

12、-β1、TIMP-1表達(dá)進(jìn)一步減弱(P<0.05)，uPA、MMP-9表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)(P<0.05)；與扶正化瘀復(fù)方組比較，扶正化瘀復(fù)方聯(lián)合HO-1抑制劑組uPA、MMP-9表達(dá)下調(diào)，TGF-β1、PAI-1、TIMP-1表達(dá)升高(P<0.05)。各相關(guān)基因蛋白表達(dá)趨勢與mRNA一致。
　　結(jié)論：
　　1.在MCD飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠模型中，TGF-β1、PAI-1、uPA、MMP-9及TIMP-1等纖維化相