骨橋蛋白在大鼠非酒精性脂肪性肝纖維化形成中的作用及機(jī)制.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是包括單純性脂肪肝(NAFL)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纖維化和脂肪性肝硬化的一組臨床病理綜合征。NAFLD患病率日益增高，對(duì)人民的健康造成嚴(yán)重危害，但NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚不明確。傳統(tǒng)概念認(rèn)為NAFL是良性病變，但最近報(bào)道認(rèn)為NAFL的良性肝細(xì)胞脂變并不是靜止的，可存在肝星狀細(xì)胞活化及細(xì)胞凋亡刺激，同時(shí)，NASH可進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化，且有研究顯示，伴有重度肥胖的NASH患者中發(fā)現(xiàn)伴有明顯肝

2、纖維化者可高達(dá)30％～42％。因此，研究非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)生機(jī)理有重要意義。 骨橋蛋白(OPN)是一種包含RGD(精-甘-門冬氨酸)整合素結(jié)合區(qū)的分泌型磷酸化糖蛋白，能夠被多種細(xì)胞所合成和分泌，參與許多生理和病理過程的發(fā)生。既往研究顯示OPN與纖維化發(fā)生密切相關(guān)。然而，OPN參與非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病及其具體的分子機(jī)制鮮有報(bào)道。有關(guān)研究顯示，OPN可與整合素β3(Integrinp3)結(jié)合，激活下游信號(hào)分子，啟動(dòng)細(xì)胞

3、內(nèi)級(jí)聯(lián)磷酸化反應(yīng)，控制細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。而粘著斑激酶(FAK)是OPN信號(hào)傳遞的重要下游信號(hào)分子，是一種非受體酪氨酸激酶，是體內(nèi)多條信號(hào)通路的交匯點(diǎn)，對(duì)細(xì)胞的發(fā)育、黏附、遷移、增殖、凋亡及細(xì)胞骨架重組具有重要作用。我們利用高脂飲食誘導(dǎo)大鼠非酒精性脂肪性肝纖維化病理過程，觀察OPN、Integrinp3、FAK在非酒精性脂肪性肝纖維化病情發(fā)展過程中的表達(dá)變化及其相互關(guān)系，尤其是與HSC活化，肝纖維化之間的關(guān)系，旨在探討骨橋蛋白在非酒精性脂肪

4、性肝纖維化發(fā)生中的作用及可能機(jī)制，為臨床有效防治本病尋找新的靶點(diǎn)。 方法： (1)建立非酒精性脂肪性肝纖維化動(dòng)物模型：選用4周齡雄性Wistar大鼠(體重180～220g)56只，隨機(jī)分為基礎(chǔ)飼料組8只(對(duì)照組，C組)、高脂飼料組48只(模型組，F(xiàn)組)，高脂飼料組分4、8、12、16、20、24周6個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)8只。(2)動(dòng)態(tài)觀察各組：①HE和Masson染色觀察肝臟組織病理改變；②苦味酸天狼猩紅染色觀察肝臟I型

5、膠原、III型膠原的表達(dá)；③血清游離脂肪酸(FFA)、甘油三脂(TG)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的變化；④免疫組織化學(xué)法檢測(cè)0[平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的陽(yáng)性表達(dá)率；⑤RT-PCR及Western blot法檢測(cè)肝組織OPN、Integrinp3、FAK的表達(dá)。 結(jié)果： 1、HE和Masson染色結(jié)果：C組大鼠肝臟無(wú)異常發(fā)現(xiàn)；F組4周大鼠肝臟出現(xiàn)脂肪變，達(dá)F(0-1)；8周時(shí)出現(xiàn)輕中度脂肪變

6、性，達(dá)F(1-3)；12周時(shí)除輕中度脂肪變性外，部分己演進(jìn)為非酒精性脂肪性肝炎，達(dá)NASH-F(1-4)G(1-2)SO診斷標(biāo)準(zhǔn)：16-20周大鼠呈中-重度脂肪肝，部分大鼠出現(xiàn)纖維組織增生、竇周/細(xì)胞周纖維化及橋接纖維化，達(dá)NASH-F(2-4)G(1-3)S(0-2)診斷標(biāo)準(zhǔn)；24周部分大鼠仍呈重度脂肪肝，但部分大鼠炎癥程度較16周時(shí)有所減輕，但均出現(xiàn)竇周/細(xì)胞周纖維化，部分可見橋接樣纖維化，少數(shù)大鼠有假小葉形成趨勢(shì)，達(dá)NASH-F(

7、2-4)G(1-2)S(1-3)診斷標(biāo)準(zhǔn)。 2、苦昧酸天狼猩紅染色結(jié)果：C組大鼠肝組織含少量膠原纖維，存在于中央靜脈、匯管區(qū)、小血管壁；F組大鼠隨喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，膠原表達(dá)呈增多趨勢(shì)，16周時(shí)可見III型膠原表達(dá)明顯增多，伴有少量I型膠原表達(dá)增多，主要分布在匯管區(qū)，部分肝組織竇周亦可見膠原表達(dá)；24周時(shí)肝組織中以I型膠原增生為主，部分增生的膠原纖維分隔肝小葉有形成假小葉趨勢(shì)。 3、血清學(xué)指標(biāo)：F組血清TG水平在4-16周明顯

8、增高，與C組比較有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，第20周、24周TG水平有所下降，與C組比較無(wú)顯著性差異。F組血清FFA水平自12周明顯增高，持續(xù)至24周，與C組比較有顯著性差異(P<0.05)。F組血清AST水平在造模4-12周明顯升高，但不同個(gè)體差異較大，故與C組比較無(wú)顯著性差異，16-20周時(shí)AST水平繼續(xù)升高，與C組比較有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，24周時(shí)血清AST水平稍有回落，但仍高于C組，與C組比

9、較有顯著性差異(P<0.05)。F組血清ALT水平4周時(shí)顯著增高，但個(gè)體差異較大，與C組比較無(wú)顯著性差異，12周-20周ALT水平持續(xù)升高，且與C組比較有顯著差異(P<0.05或P<0.01)，24周血清ALT水平稍回落，但高于C組，與C組比較有顯著性差異(P<0.05)。 4、免疫組織化學(xué)染色： C組、F組4周、8周時(shí)α-SMA僅在血管壁有少量表達(dá)，呈淺棕黃色染色，F(xiàn)組12周時(shí)，除血管壁可見陽(yáng)性表達(dá)外，小葉內(nèi)可見少量陽(yáng)性細(xì)胞表

10、達(dá)，呈散在分布的淺棕褐色染色，16周陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)開始逐漸增多，并在纖維束沉積部位著色深，20周陽(yáng)性染色進(jìn)一步增多，24周陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)最多、染色深，呈棕褐色，陽(yáng)性細(xì)胞多位于匯管區(qū)、肝血竇周圍以及纖維間隔等處。 5、RT-PCR和Western blot結(jié)果：F組大鼠肝組織OPN mRNA和蛋白表達(dá)隨喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高，12-24周時(shí)與C組比較有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。F組肝組織Integrinβ3 mRNA

11、和蛋白表達(dá)有增高趨勢(shì)，但在4-16周變化不明顯，與C組比較無(wú)顯著性差異，在20-24周時(shí)Integrinp3 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高，且與C組比較有顯著性差異(P<0.01)。F組大鼠肝組織FAKmRNA和FAK-PY397蛋白表達(dá)隨喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈增高趨勢(shì)，F(xiàn)AK-PY397蛋白表達(dá)在24周時(shí)有所回落，16-24周時(shí)FAKmRNA和FAK-PY397蛋白表達(dá)與C組比較有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。 結(jié)論：