PNPLA3基因I148M多態(tài)性在非酒精性脂肪性肝纖維化中的機制研究.pdf

1、目的:在動物和細胞水平上探究PNPLA3 I148M基因多態(tài)性對Hedgehog(Hh)信號通路表達的影響，從而揭示PNPLA3 I148M基因多態(tài)性在非酒精性脂肪性肝纖維化中作用機制。
　　方法:采用顯微注射法構(gòu)建了野生型純合子(pNpLA3+/+)、雜合子(PNPLA3148M/+)、突變型純合子(PNPLA3148M/M)三種轉(zhuǎn)基因小鼠模型，在相同環(huán)境下，采用正常飲食、飲水飼養(yǎng)16周后，將小鼠在乙醚麻醉后迅速解剖，從心臟采取

2、血液標本，檢測血清中的TG、TC、ALT、AST的水平，獲取小鼠新鮮的肝臟組織標本，采用熒光定量PCR的檢測Hh信號通路基因以及與細胞增殖凋亡相關(guān)基因的表達，采用western blot在蛋白水平上對上述基因的表達進行驗證。在細胞實驗方面，運用雙酶切的方法合成PNPLA3 I148M野生型及突變型的基因序列和慢病毒載體序列，將目的基因序列和載體序列進行連接，合成攜帶目的基因的載體質(zhì)粒并對其純化擴增及轉(zhuǎn)染293T細胞，從而獲得高滴度攜帶P

3、NPLA3不同基因型的慢病毒;采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染HSC-T6細胞，利用嘌呤霉素對轉(zhuǎn)染的HSC-T6細胞株進行篩選，構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達PNPLA3 I148M野生型和突變型基因細胞系，在此基礎(chǔ)上，分別檢測過表達PNPLA3 I148M野生型和突變型基因的HSC-T6細胞內(nèi)Hh信號通路及與細胞增殖凋亡相關(guān)基因的表達情況，并采用Western blot進行蛋白水平上的驗證。定量資料以“均數(shù)±標準差”進行表述，采用獨立樣本t檢驗對定量資料進

4、行統(tǒng)計學分析;檢驗標準設(shè)定為P＜0.05。
　　結(jié)果:(1)與PNPLA3+/+小鼠相比，PNPLA3148M/M小鼠血清中ALT水平高于PNPLA3+/+小鼠，結(jié)果有統(tǒng)計學意義。(2)與PNPLA3+/+小鼠相比，PNPLA3148M/+和PNPLA3148M/M小鼠肝臟組織內(nèi)shh、patched、smo、gli-1等基因的表達明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義。(3)與PNPLA3+/+小鼠相比，我們發(fā)現(xiàn)PNPLA3148M/+和

5、PNPLA3148M/M小鼠肝臟組織內(nèi)bcl-2，PDGF和TGFβ1等基因的表達明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義。(4)成功組裝了攜帶PNPLA3 I148M野生型和突變型基因的慢病毒，并成功感染了HSC-T6細胞，采用倒置熒光顯微鏡觀察，綠色熒光陽性率達到85％，采用嘌呤霉素篩選后，陽性率達到95％以上。采用Western blot驗證野生型組和突變型組細胞內(nèi)PNPLA3蛋白較空載體對照組細胞表達增加，證實過表達PNPLA3 I148M

6、野生型和突變型基因的HSC-T6細胞株構(gòu)建成功。(5)PNPLA3 I148M突變基因過表達的HSC-T6細胞系內(nèi)shh、patched、smo、gli-1等基因的相對表達量明顯高于野生型細胞組，差異具有統(tǒng)計學意義。(6)與PNPLA3 I148M野生型細胞相比，突變型細胞內(nèi)bcl-2，PDGF和TGFβ1表達明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:PNPLA3 I148M基因突變可能通過促進Hh信號通路的激活，引起肝星狀細胞的