安顫靈對帕金森病模型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與泛素—蛋白酶體系統(tǒng)的影響.pdf

1、目的：
　　 帕金森病(Parkinson disease,PD)是漸行性神經(jīng)退行性疾病,表現(xiàn)為黑質(zhì)紋狀體中多巴胺能神經(jīng)元的進行性死亡,神經(jīng)元胞漿內(nèi)包涵體Lewy小體增多。PD的病因至今仍未完全明確,但公認的機制有興奮性毒性和能量代謝紊亂、氧化應(yīng)激、線粒體活性下降等功能紊亂。環(huán)境因素比如殺蟲劑和其他因素也可以誘發(fā)散發(fā)性PD,而散發(fā)性PD占全部病例了90％以上。最近研究表明,PD疾病的發(fā)生與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和泛素一蛋白酶體系統(tǒng)有關(guān)。本課

2、題結(jié)合國際帕金森病研究的最新進展和動態(tài),采用腹腔注射MPTP誘導(dǎo)模擬人的PD慢性病程的動物模型,研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)與帕金森病發(fā)病的關(guān)系;同時進行天然中藥新藥安顫靈的藥效學(xué)作用機理研究,為其進一步中藥新藥開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.動物實驗:
　　 (1)建立PD模型及實驗分組:
　　 選取健康雄性C57BL/5J小鼠60只(9周齡),隨機分成5組,分別為PD模型組12只,予

3、小鼠腹腔體內(nèi)注射MPTP(30mg/kg.d),同時蒸溜水灌胃與安顫靈組等體積。正常對照組12只,蒸溜水灌胃與模型組相同,腹腔注射改為相同體積的生理鹽水(30mg/kg.d)。安顫靈組(分高、中、低劑量組),每組各12只,該組在模型組基礎(chǔ)上將灌胃的蒸溜水改為以上不同劑量的中藥煎液。
　　 (2)動物行為學(xué)觀察:
　　 注射后7d、14d和21d按0.25mg/kg腹腔注射阿撲嗎啡,觀察旋轉(zhuǎn)行為的變化,共記錄30min取平

4、均值。同時注意觀察小鼠震顫、活動遲緩、抓握、嗅探等異常行為。
　　 (3)黑質(zhì)區(qū)TH、GFAP、OX-42免疫組化檢測:
　　 注射后第21天,在2.5%戊巴比妥鈉麻醉下,從左心室插管灌注4%多聚甲醛,之后斷頭取腦,經(jīng)系列生化固定后。自近黑質(zhì)部位起連續(xù)冠狀切片,挑取對稱的黑質(zhì)區(qū)切片。行TH、GFAP、OX-42免疫組織化學(xué)染色,觀察中腦黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(TH)陽性細胞,星形膠質(zhì)細胞(GFAP)及小膠質(zhì)細胞(OX-42)的

5、變化,以了解DA能神經(jīng)元損毀情況以及是否選擇性地損毀多巴胺能神經(jīng)元以及小膠質(zhì)細胞的激活。切片再經(jīng)系列生化免疫標記,置顯微鏡觀察,計數(shù)陽性細胞數(shù)。
　　 (4)a-synuelein、Parkin和泛素(ubiquitin)的免疫組化檢測:
　　 通過免疫組織化學(xué)染色法觀察DA能神經(jīng)元lewy小體的主要成分a-共核蛋白(a-synue lein)、Parkin和泛素(ubiquitin)的表達。切片經(jīng)系列生化免疫標記后,顯

6、微鏡觀察,顯微圖象分析檢測。模型組、正常組、安顫靈組處理時間和劑量完全相同。
　　 (5)RT-PCR檢測黑質(zhì)區(qū)組織Caspase-12 mRNA的表達:
　　 GenBank檢索小鼠Caspase-12序列,自行設(shè)計引物,由上海Sangon公司合成。Caspase-12引物(506bp)上游:5'-AGGCAACTCTCATGCAGTTC-3'(1319-1338bp),下游:5'-AACCATGTATGCCAGAG

7、AC C-3'(1847-1866 bp)。取總RNA4 ul,加入01ig(dT)1 ul,65℃15 min,立即置冰上;加人10XRT緩沖液2μl,dNTP2ul,25 mmol/L MgC122μl,RNA酶抑制劑1μl,A-MV1μl,加DEPC處理水至總體積20μl,42℃60 min逆轉(zhuǎn)錄;取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA4μl,加入10%PCR緩沖液5μl,dNTP1μl,Caspase-12上游、下游引物各2μl(20 pm01)

8、,Taq酶(5 U/μl)0.25μl,25 mmol/L MgC123μl,加無菌雙蒸水至總體積50μl。PCR條件:94℃5 min,94℃40 s,55℃40 s,72℃90 s,35個循環(huán);72℃10 min。取PCR擴增產(chǎn)物10μl行瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描caspase-12灰度值.。比較各組黑質(zhì)區(qū)組織caspase-12 mRNA的表達。(6)Western blot檢測黑質(zhì)區(qū)組織caspase-12,CHOP、

9、Bip/GRP78蛋白的表達:
　　 50 mg小鼠黑質(zhì)組織用1%TritonX-100加蛋白酶抑制劑裂解,用牛血清白蛋白方法檢測蛋白含量。每一樣品取總蛋白30 ug上樣,用12%不連續(xù)聚丙烯酞胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)蛋白至硝酸纖維素膜;5%脫脂奶粉封閉2h;加進入Caspase-12、CHOP、Bip/GRP78第一抗體輕搖2h后4℃過夜;Tris磷酸鹽緩沖液洗膜15 min,共3次;加人辣根過氧化物酶標記的第二抗體37℃1 h,Tri

10、s磷酸鹽緩沖液洗膜15 min,共3次?；瘜W(xué)發(fā)光試劑作用后x膠片曝光,經(jīng)顯影、定影等處理后觀察結(jié)果。用凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像,對其灰度分析,比較各組黑質(zhì)區(qū)組織Caspasc-12,Bip/GRP78蛋白的表達。(7)數(shù)據(jù)統(tǒng)計:數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用均值(-x)±標準差(s),采用SAS軟件包行單因素方差分析檢驗,以P＜0.05表示有顯著性差異。
　　 2.離體實驗:安顫靈對H2O2誘導(dǎo)PC12細胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響
　　 (1)

11、細胞株及培養(yǎng)體系:
　　 PC12細胞是小鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株,由中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所提供。細胞接種在預(yù)先鋪過鼠尾膠的培養(yǎng)皿中,用含有10%胎牛血清和10%馬血清的DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco BRL公司),同時加入2mmol/L谷氨酰胺、100u/ml鏈霉素和100u/ml青霉素,在溫度37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天傳代細胞1次,實驗所用的細胞均處于對數(shù)生長期,且存活細胞百分率均在95%

12、以上(臺盼蘭拒染法)。
　　 (2)實驗分組和處理:
　　 在24孔培養(yǎng)板上,按每孔1.25×105個細胞的濃度加入PC12,在DMEM中培養(yǎng)4h后,加入高、中、底不同濃度的安顫靈含藥血清(50,100,200ug/ml)預(yù)處理3d,然后將細胞暴露與200mMH2O2中。經(jīng)12h共同培養(yǎng)后,測定細胞的凋亡/死亡和存活情況。設(shè)正常和模型對照,實驗重復(fù)3次。
　　 (3)PC12細胞DNA倍體的分析:
　　

13、在100μl樣本液中加人含50 mg/L碘化丙啶(美國BD公司)和50 mg/L核糖核酸酶A(上海生工生物工程公司)的染液500μl,避光37℃孵育30min,流式細胞儀采集數(shù)據(jù)進行亞二倍體峰(subGl)的百分比分析。每份標本利用cellQuestTM軟件分析10000個細胞,結(jié)果用百分比表示。
　　 (4)凋亡細胞染色和熒光觀察:
　　 棄去介質(zhì)和處理因素,用1×D-PBS輕輕清洗細胞一次。直接在細胞上添加適當(dāng)量(約

14、在24孔培養(yǎng)板上按50uL/孔,在12孔培養(yǎng)板上按100uL/孔或6孔培養(yǎng)板上按150uL/孔)的聯(lián)合染液(2mM calcein AM和4mM EthidiumHomodimer-1),在室溫下孵育30分鐘。標記的存活和死亡細胞用熒光顯微系統(tǒng)(Zeiss Axiovert135M,Mercury Lamp,Carl Zeis HBO100W/Z),以485nm和590nm立即觀察和拍照。
　　 結(jié)果：
　　 1.動物實

15、驗結(jié)果:
　　 1.1造模及行為學(xué)結(jié)果:腹腔注射MPTP后,PD模型組小鼠于第1次注藥后10-20 min均出現(xiàn)不同程度的震顫、豎毛、翹尾,上述癥狀持續(xù)4-5h后逐漸減輕,但仍有活動減少,動作遲緩等變化。治療前模型組和安顫靈組組間的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)無顯著性差異(P＞0.05)。治療后,實驗第7天、第14天和第21天安顫靈組小鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)逐漸減少,分別與模型組相比,差異顯著(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01)。懸掛行為結(jié)果顯示:實驗

16、前1天(即首次注射MPTP前1天)觀察小鼠懸掛行為,模型組、安顫靈組小鼠評分分別與對照組相比,無差異(P＞O.05、P＞0.05);實驗第7天、第14天和第21天觀察模型組小鼠懸掛行為,其評分明顯降低,分別與對照組相比,差異顯著(P＜0.01、P＜0.05);實驗第14天和第21天安顫靈組小鼠懸掛實驗評分明顯升高,分別與模型組相比,差異顯著(P＜0.01、P＜0.01)。實驗前1天觀察小鼠爬桿行為,模型組、安顫靈組小鼠評分分別與對照組相

17、比,無差異(P＞0.05、P＞0.05)。注射MPTP第7天、第14天和第21天觀察模型組小鼠爬桿行為,其評分明顯降低,分別與對照組相比,差異顯著(P＜0.01、P＜0.05、),提示造模成功。實驗第14天和第21天安顫靈組評分明顯升高,分別與模型組相比,差異顯著(P＜0.05、P＜0.05)。
　　 1.2.免疫組化、RT-PCR、Westernblot檢測結(jié)果:1.2.1免疫組化結(jié)果:PD模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH表達顯著降低(P

18、＜0.01),GFAP、OX-42表達增多。經(jīng)安顫靈灌胃處理的各組小鼠TH較模型組增多(P＜0.01),而GFAP、OX-42陽性細胞數(shù)無明顯變化。與模型組相比,中藥安顫靈組a-synuclein、Parkin、ubiquitin陽性細胞數(shù)均減少(P＜0.01)。1.2.2 RT-PCR結(jié)果提示,腹腔注射MPTP可誘導(dǎo)小鼠腦黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),而安顫靈對這一應(yīng)激反應(yīng)有一定的緩解作用。1.2.3.Wes tern blot檢測結(jié)

19、果顯示:模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)caspase-12、CHOP蛋白表達水平較正常對照組顯著上調(diào)(P＜0.01),提示黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)提高。安顫靈組caspase-12、CHOP蛋白表達水平較模型組明顯降低(P＜0.05)。模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)組織GRP78/Bip蛋白的表達較正常對照組上調(diào),安顫靈組GRP78/Bip蛋白的表達較模型組進一步上調(diào)(P＜0.05)。
　　 2.離體實驗結(jié)果:
　　 實驗光鏡下觀察發(fā)現(xiàn),對照組

20、PC12細胞排列整齊,貼壁生長旺盛,形態(tài)規(guī)則,呈長梭形或長棱形,有長短不等的類似神經(jīng)軸突的偽足,交織成網(wǎng)狀。H2O2損傷后的模型組細胞,排列紊亂,貼壁不牢,偽足縮短火消失,大量細胞懸浮,碎裂,死亡。安顫靈含藥血清培養(yǎng)細胞變化較模型組明顯減弱。細胞排列尚整齊,懸浮細胞較少,可見明顯偽足。與大、小劑量組相比,中劑量組細胞的存活率顯著升高(P＜0.01);與正常組相比,模型組細胞凋亡指數(shù)明顯增加(P＜0.01),a-synuclein、陽性細

21、胞數(shù)亦均增多,而TH陽性細胞明顯減少;與H2O2組相比,安顫靈組細胞凋亡指數(shù)明顯降低,a-synuclein陽性細胞數(shù)均減少,TH陽性細胞明顯增加(P＜0.01)。H2O2模型組PC12細胞與正常對照組相比細胞周期明顯左移。在細胞G1/G0期前有明顯的亞二倍體峰(subG1/G0),處于此期的細胞比率為(94.50±21.3)%,而正常對照組處于此期的細胞比率為(1.36±2.0)%。而且H2O2模型組G1/G0期及所占的比率明顯低于正

22、常對照組,G2期及M期的細胞所占的比例也減少,在細胞周期圖中代表這兩期的峰幾乎不可見。而同時給予不同濃度安顫靈含藥血清(2.5%、5%、10%)孵育后,Pcl2細胞subG1/G0百分比分別為(82.90±12.6)%、(69.34±15.7)%、(51.63±6.8)%。
　　 結(jié)論：
　　 中藥安顫靈小鼠行為學(xué)表明,采用MPTP注射法,造模成功;安顫靈能提高肢體運動協(xié)調(diào)能力,對MPTP誘導(dǎo)所致的PD模型小鼠PD運動體

23、征具有明顯的改善作用。ESR和UPS可能是PD多巴胺能神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵因素,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的早期調(diào)節(jié)過程就存有泛素-蛋白酶體系統(tǒng)對異常蛋白的降解活動。ERS和UPS有相互促進作用,以達到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成與降解的動態(tài)平衡,保證內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。中藥安顫靈就是通過黑質(zhì)區(qū)組織Caspase-12 mRNA的表達和Caspase-12,CHOP、Bip/GRP78蛋白的表達靶點的干預(yù)來實現(xiàn)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(ESR)影響和改善,減少細胞毒性蛋白的合成。通過

24、a-synuelein、和泛素(ubiquitin)蛋白的表達靶點的干預(yù)來實現(xiàn)對UPS的影響和改善,提高發(fā)現(xiàn)和破壞這些裝配和折疊錯誤的蛋白的能力,使它們及時降解,消除細胞毒性蛋白,達到改善保護黑質(zhì)區(qū)DA能神經(jīng)元神經(jīng)細胞,減少細胞凋亡。同時,對H202誘導(dǎo)的神經(jīng)元ERS與凋亡反應(yīng)具有顯著地拮抗作用,從而達到保護細胞的作用。提示,H2O2能誘導(dǎo)細胞凋亡,而安顫靈可抑制這一細胞凋亡過程。腹腔注射MPTP可誘導(dǎo)C57小鼠黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的內(nèi)ESR,