蛋白酶復合體抑制減少內質網糖蛋白質量監(jiān)控系統(tǒng)組分及其在帕金森病中的研究.pdf

1、目的:
　　泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)是細胞內蛋白質主要的降解途徑之一，廣泛參與了應激反應、細胞周期、凋亡及細胞信號傳導、離子通道調節(jié)、蛋白質分泌在內的調節(jié)過程。在阿爾茲海默癥、帕金森病、肌肉側索硬化癥等神經退行性疾病中，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)受到抑制在疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮了一定的作用。鈣網蛋白(calreticulin)/鈣聯接蛋白(calnexin)(CRT/CNX)是內質網中重要的糖蛋白折疊監(jiān)控系統(tǒng)，正確折疊的蛋白質留在內質網

2、中或轉運到相應的細胞器或胞外;輕度或中度錯誤折疊的蛋白質在CRT/CNX質量監(jiān)控系統(tǒng)的協助下重新折疊;高度錯誤折疊而無法修復的蛋白質被逆轉運到胞漿中被蛋白酶復合體降解，泛素-蛋白酶復合體失活和CRT/CNX糖蛋白質量監(jiān)控系統(tǒng)功能紊亂將導致死亡或發(fā)育延遲。本課題主要研究在神經元損傷早期，蛋白酶復合體抑制情況下，內質網糖蛋白質量監(jiān)控系統(tǒng)的改變，以及其改變機制，并在帕金森氏動物模型中研究蛋白酶復合體抑制對內質網質量監(jiān)控系統(tǒng)的調控
　　方

3、法：
　　1.蛋白酶體活性檢測實驗
　　取孕18天SD-大鼠胚胎，分離皮質及黑質區(qū)組織進行原代神經元培養(yǎng)，7天后用非變性細胞裂解液裂解細胞，提取蛋白。將提取的蛋白質和蛋白酶復合體酶切底物LLVY-AMC共同孵育，蛋白酶復合體在糜蛋白酶切割作用下產生AMC，在Ex380nm、Em440nm下檢測熒光值，熒光值和蛋白質的比值表示蛋白酶體復合體的活性。
　　2.細胞毒性試驗
　　將CRT穩(wěn)定knockdown的SH-S

4、Y5Y細胞用不同濃度6-羥基多巴胺處理24小時后，加MTS檢測吸光度，MTS是四唑類化合物，可被活細胞的線粒體內多種脫氫酶還原成橙黃色的formazan，從而反應細胞活力。
　　3.用ELISA檢測經不同濃度蛋白酶體抑制劑處理的皮質及黑質區(qū)原代神經細胞上清中分泌的calreticulin。
　　4.Western blot檢測蛋白酶復合體抑制劑處理原代培養(yǎng)神經元后，內質網質量監(jiān)控系統(tǒng)CRT/CNX組分calreticulin

5、，calnexin，ERp57的表達變化。
　　5.用立體定位儀向SD-大鼠單側紋狀體定位注射6-羥基多巴胺建立帕金森氏病動物模型，提取大鼠雙側皮質、紋狀體、中腦蛋白質，對比檢測calreticulin，calnexin，ERp57和GRP78的變化，并做免疫組化分析相應蛋白質的改變。
　　結果：
　　1.在神經元未發(fā)生凋亡的前提下，1um蛋白酶復合體抑制劑處理原代神經元后，CRT、ERp57的蛋白水平下降，而CRT/

6、CNX質量監(jiān)控系統(tǒng)的calnexin及內質網中另一分子伴侶GRP78蛋白水平沒有改變;在蛋白酶復合體抑制劑處理神經元的上清中檢測到CRT含量增加，當加入抑制蛋白質從內質網向高爾基體轉運的特異性蛋白轉運抑制劑Brefeldin A后，這種變化受到抑制。
　　2.在多巴胺能神經元細胞系SH-SY5Y中穩(wěn)定knockdown CRT，增加了SH-SY5Y對多巴胺能神經毒素6-羥基多巴胺的毒性敏感性。
　　3.在帕金森動物模型中，6

7、-羥基多巴胺注射側黑質區(qū)CRT和ERp57表達與對照側相比顯著下降，而GRP78和calnexin沒有變化;同時黑質區(qū)神經元細胞的蛋白酶復合體活性較對側明顯降低，雙側大腦皮質、紋狀體中CRT、ERp57、CNX、GRP78對比沒有差異，蛋白酶復合體活性也沒有改變。
　　結論：
　　蛋白酶復合體抑制在不引起神經元凋亡的前提下，減少內質網CRT/CNX質量監(jiān)控系統(tǒng)蛋白質組分CRT，ERp57的蛋白質含量，CRT的減少是由于蛋白酶