甘藍型油菜株型及角果長度相關miRNA和靶基因的挖掘.pdf

1、microRNAs(miRNAs)是一類21-24nt的內源非編碼小分子RNA，參與調控植物的發(fā)育、衰老、死亡及對各種逆境脅迫響應等。株型是一個重要的農藝性狀，與作物的育種潛力，產量，收獲方式息息相關。雖然有很多基因被報道參與調作物控株型，但是油菜中miRNA參與株型調控的研究還不多。本研究通過高通量測序手段對頂端組織和早期發(fā)育的角果中的miRNA和靶基因進行挖掘，以期對株型調控的分子機理有一定了解，結果如下:
　　1.矮桿緊湊型

2、甘藍型油菜株型相關miRNA及靶基因的挖掘
　　本課題組發(fā)現(xiàn)了一種棒狀株型油菜突變體，其具有重大的育種潛力。以回交后代中矮桿緊湊株型油菜突變體(rodlike)和正常株型油菜（normal）為實驗材料，對其莖頂端進行四個sRNA組學測序（兩次生物學重復）和兩個降解組測序，挖掘參與調控株型的miRNAs。對高通量測序結果進行生物信息學分析，最終在四個小RNA文庫中共檢測到了925個miRNA前體;進一步分析發(fā)現(xiàn)315個miRNA前體

3、對應著74個已知的miRNA歸屬于38個miRNA家族，610個miRNA前體歸屬于327個新的miRNA。對MIRNA家族成員進行分析，發(fā)現(xiàn)miR169家族成員最多，其次是miR156家族，并發(fā)現(xiàn)一些miRNA家族成員在基因組上呈現(xiàn)串聯(lián)重復或者隨機復制事件。差異miRNA分析結果得到5個已知miRNA和4個novel miRNA在棒狀突變體中顯著上調表達;另外，5個已知miRNA和3個novel miRNA在棒狀突變體中顯著下調表達，

4、并通過實時定量驗證了miRNAs表達與測序結果一致。
　　利用降解組測序鑒定到408個靶基因，其中25個已知miRNA家族的264個靶基因和58個novel miRNAs對應的144個靶基因。通過5'RACE驗證了7個已知miRNA和1個novel miRNA的14個靶基因，證明降解組測序結果的可靠性。同時，挑選了4個差異miRNAs及其靶基因分析它們之間的關系，發(fā)現(xiàn)它們呈負相關性，表明miRNA-target在頂端起作用。

5、>　　進一步分析表明，營養(yǎng)元素/金屬離子匱乏，能量供應不足，衰老/早熟機制，還有miR319/miR164調控的TCP轉錄因子參與的分生組織活動可能導致頂端分生組織的提前終止。更重要的是轉基因結果表明TCP4基因能抑制頂端的生長，導致頂端終止發(fā)育。因此，我們推測miR319調控的TCP轉錄因子可能對雙子葉植物株型的調控起重要的作用。此外，本研究中預測到的novel miRNA的功能為油菜中miRNA的研究提供了大量有用數(shù)據(jù)。
　　

6、2.甘藍型油菜角果長度相關miRNA的挖掘
　　本研究對回交后代中長角果(LS)和短角果(SS)材料開花0-7天的角果進行小RNA測序，構建了4個小RNA文庫（兩次重復）。測序結果總共鑒定到814個miRNA前體，其中255個前體代表36個miRNA家族的65個已知miRNA，559個前體代表394個novel miRNA。研究發(fā)現(xiàn)novel miRNA中有一些是已知miRNA的變異，如novel_mir_65和novel_mir

7、_80與bna-miR164只有4個堿基差異，推測novel miRNA在進化上會越來越少，逐漸趨向于已知miRNAs。長短角果材料中的差異表達分析顯示17個miRNAs在LS和SS中存在顯著差異，進一步通過qRT-PCR驗證了9個miRNA定量結果與測序結果基本一致。
　　構建了LS和SS兩個降解組文庫，總共鑒定到522個剪切事件，包括33個已知miRNA介導的371個剪切事件和58個novel miRNA介導的151個剪切事件

8、，且5'RLM-RACE驗證的結果與降解組測序結果相符。
　　進一步分析了5個差異表達的miRNAs及其靶基因在兩個材料0，3，5，7DAP角果中的動態(tài)表達模式，其中miR160和novel_mir_11在角果發(fā)育的各個時期都下調表達，表明這些miRNAs可能對角果發(fā)育起重要作用。進一步研究證實miR160在角果中有活性，并且在油菜中超量表達miR160抑制生長素響應因子的表達，轉基因植株生長旺盛，角果長度增加，揭示了角果長的發(fā)育