甘藍型油菜BnFUL和BnSHP的克隆及轉基因研究.pdf

1、油菜是重要的油料作物，收獲前和收獲時的裂果現(xiàn)象給生產(chǎn)造成嚴重損失。本論文首先通過生物信息學蛋白序列比對方法，尋找甘藍型油菜與開裂相關的基因，進一步克隆了2個基因組基因以及1個基因的片段，并進行了時空表達分析。在此基礎上構建載體，建立和優(yōu)化油菜遺傳體系進行轉基因工作，并對獲得的擬轉化植株進行了初步的分子鑒定。獲得以下主要結果：
　　 1.通過與十字花科擬南芥果實開裂基因的核苷酸序列及其氨基酸序相比較，發(fā)現(xiàn)油菜BnFUL、BnSHP

2、1、BnSHP2與擬南芥AtFUL、AtSHP1、AtSHP2的相似度分別高達93％、92％、92％；PFAM軟件分析表明，可能與油菜果實開裂相關基因都有一個約50個AA的MADS-box保守結構域，這與擬南芥是相同的。因此我們預測BnFUL、BnSHP1、BnSHP2可能調控油菜果實開裂的過程。
　　 2.以油菜基因組DNA為模板，克隆并測定了BnSHP1、BnSHP2的編碼區(qū)序列。結果表明：BnSHP1基因編碼區(qū)長達2756

3、 bp，有7個外顯子和6個內(nèi)含子；BnSHP2基因編碼區(qū)長達3238bp，有6個外顯子和5個內(nèi)含子。
　　 3.通過RT-PCR對BnFUL、BnSHP1、BnSHP2時空表達進行了分析，結果表明，BnFUL在植物各個器官中廣泛表達，BnSHP1、BnSHP2有相似的表達模式，主要在花和果實中表達；BnSHP2在莖、葉、花序軸均沒有表達，而BnSHP1在莖中有微量得表達，葉和花序軸中沒有表達。
　　 為了確認油菜開裂基因

4、的功能，我們利用中間表達載體pSK和植物雙元表達載體pCanG，構建了BnFUL超表達、BnSHP2 RNA干涉植物表達載體，并將它們成功轉入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中。
　　 通過對根癌農(nóng)桿菌轉化多種因素的比較和探索，優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導的油菜遺傳轉化體系。采用甘藍型油菜從子葉節(jié)處切開的帶柄子葉為外植體，經(jīng)農(nóng)桿菌感染10～30 min，共培養(yǎng)48 h，在含卡那霉素（Kan）8～10 mg/L和氨芐青霉素（Amp）100 mg/L的

5、培養(yǎng)基上篩選得到轉化體。以BnFUL超表達、BnSHP2 RNA干涉植物表達載體轉化甘藍型油菜，結果表明：經(jīng)過卡那霉素篩選，BnFUL和BnSHP2轉化分別獲得48和15株抗性再生植株，以新霉素磷酸轉移酶基因NPT Ⅱ的引物對抗性植株基因組DNA進行了PCR檢測，BnFUL和BnSHP2分別有3和2株PCR檢測為陽性。BnFUL超表達載體轉化，轉化效率為0.18％；BnSHP2干涉載體轉化，轉化效率為0.12％。
　　 本研究為