甘藍(lán)型油菜抗旱相關(guān)基因BnBiP的克隆與功能鑒定.pdf_第1頁(yè)
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1、干旱、冷害、鹽堿等非生物逆境嚴(yán)重影響了作物產(chǎn)量和品質(zhì)。而干旱是最為普遍的非生物逆境形式,限制了作物的種植范圍,因而抗旱育種顯得尤為重要。本研究從甘藍(lán)型油菜中克隆到干旱脅迫相關(guān)基因BnBiP,通過(guò)在甘藍(lán)型油菜中超量表達(dá),對(duì)這個(gè)基因的功能進(jìn)行了分析和鑒定,并對(duì)這個(gè)基因進(jìn)行了抗逆性機(jī)制的探討。主要結(jié)果如下:
   1.根據(jù)已知的大豆中的soyBiPD(Accession no.AF031241)的cDNA序列設(shè)計(jì)引物從甘藍(lán)型油菜中擴(kuò)增

2、到763bp的片段,再利用Gene RACE的方法獲得BnBiP的cDNA序列。BnBiP基因最大開(kāi)放閱讀框?yàn)?991bp編碼了650 aa。利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)對(duì)BnBiP基因編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)BnBiP基因在植物中是高度保守的,其編碼序列內(nèi)有3個(gè)Hsp70保守結(jié)構(gòu)域。
   2.在載體pBI121(含CaMV35S啟動(dòng)子)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了Bn

3、BiP超量表達(dá)載體。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜,得到21株T0代卡那霉素抗性超量表達(dá)目的基因的株系。PCR結(jié)果分析顯示,目的基因已整合到抗性植株中。RT-PCR和Real-time結(jié)果表明其中16個(gè)T0代轉(zhuǎn)基因株系,轉(zhuǎn)基因植株BnBiP基因相對(duì)于對(duì)照表達(dá)豐度增加。
   3.E3泛素連接酶基因SDIR參與環(huán)境脅迫下的ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在擬南芥中超量表達(dá)SDIR可提高其抗旱性(Zhang et al;2007)。

4、酵母雙雜交結(jié)果顯示,BnBiP蛋白和SDIR蛋白之間無(wú)互作關(guān)系,據(jù)此推測(cè)BnBiP未參與SDIR基因所介導(dǎo)的植物抗逆途徑。
   4.衣霉素通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的糖基化導(dǎo)致未折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)積累,引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。超量表達(dá)BnBiP的T0代種子在含有5μg/ml衣霉素的培養(yǎng)基上發(fā)芽率高于對(duì)照,且超量表達(dá)BnBiP的T1代植株在衣霉素脅迫下表現(xiàn)出較好的抗性。說(shuō)明BnBiP作為一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的分子伴侶,可以減緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激脅迫。

5、   5.通過(guò)RT-PCR和Real-time PCR分析,得出BnBiP的表達(dá)受干旱脅迫誘導(dǎo),其表達(dá)量在干旱脅迫1-2h內(nèi)顯著上升。對(duì)生長(zhǎng)4-6葉期的甘藍(lán)型油菜經(jīng)過(guò)20%PEG-6000模擬干旱脅迫12h或者斷水處理14d,轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性。
   6.在20%PEG-6000滲透脅迫下分析BnBiP和其他逆境相關(guān)基因如NRP信號(hào)途徑(誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑)中的AtNRP和GmNAC6基因的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照

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