2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、目的:乙型肝炎病毒(HBV)引起的慢性感染是肝癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素。文獻(xiàn)報(bào)道及我們前期研究證明HBV感染可誘導(dǎo)IL-23和IP-10的表達(dá),且在HBV感染的病人血清以及組織中呈高表達(dá)。已有報(bào)道表明某些細(xì)胞因子,如IL-23能促進(jìn)細(xì)胞的增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移等,發(fā)揮著促腫瘤的作用;IL-23及IP-10等細(xì)胞因子亦能促進(jìn)T細(xì)胞的浸潤(rùn),發(fā)揮免疫應(yīng)答功能,抑制腫瘤生長(zhǎng)。HNF4α是肝細(xì)胞分化因子,在肝臟、腎以及小腸的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。而且H

2、NF4α與炎癥密切相關(guān),是諸多細(xì)胞因子的靶分子,IL-1、IL-6及TNF等細(xì)胞因子對(duì)其表達(dá)以及活性均有影響。IL-23或IP-10是否在HBV感染引起的慢性炎癥中影響HNF4α的表達(dá),以及對(duì)肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制仍不清楚。本研究旨在探討HBV誘導(dǎo)IL-23、IP-10及其受體在不同肝細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制,為以其為靶點(diǎn)的腫瘤干預(yù)策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
  方法:①HepG2和HepG2.21

3、5中細(xì)胞炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF、IL-23、HMGB1、IL-17以及IL-33)的表達(dá)采用RT-PCR檢測(cè)。②不同肝細(xì)胞系中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78、肝細(xì)胞分化相關(guān)分子HNF4α以及HNF4α靶基因G6Pase表達(dá)的檢測(cè):肝細(xì)胞系LO2、HepG2、Huh-7以及HepG2.215中GRP78、HNF4α和G6Pase mRNA水平的表達(dá)采用RT-PCR檢測(cè);肝細(xì)胞系LO2、HepG2、Huh-7以及HepG2.215

4、中GRP78和HNF4α蛋白水平的表達(dá)采用Western Blot檢測(cè)。③肝癌細(xì)胞HBV瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后GRP78以及HNF4α表達(dá)的檢測(cè):HepG2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBV24h、48h以及72h后GRP78和HNF4αmRNA的表達(dá)采用RT-PCR檢測(cè);HepG2和Huh-7瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBV72h后GRP78和HNF4α蛋白水平的表達(dá)采用Western Blot檢測(cè)。④檢測(cè)IL-23受體(IL-23R)以及IP-10受體(CXCR3)在肝癌細(xì)胞系中的

5、表達(dá):肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh-7和HepG2.215中IL-23R的表達(dá)采用RT-PCR檢測(cè);HepG2和HepG2.215細(xì)胞中IL-23R以及CXCR3的表達(dá)采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè);HepG2、Huh-7和HepG2.215細(xì)胞中IL-23R以及CXCR3的表達(dá)采用免疫熒光檢測(cè)。⑤肝癌組織標(biāo)本中CXCR3的表達(dá)采用細(xì)胞免疫組化法(組織切片)檢測(cè)。⑥細(xì)胞因子對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)影響實(shí)驗(yàn):細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):不同濃度IL-23或IP-

6、10(0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)刺激細(xì)胞48h后,CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖率;細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn):不同濃度IL-23或IP-10(0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)刺激細(xì)胞24h后,固定過夜,PI染色后流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期變化;細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn):無血清狀況下加入不同濃度的IL-23或IP-10(0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng

7、/ml,40ng/ml)培養(yǎng)細(xì)胞48h,Annexin V-FITC和PI染色,F(xiàn)CM檢測(cè)細(xì)胞凋亡;細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn):細(xì)胞接種至六孔板,IL-23(0ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)或IP-10(0ng/ml,10ng/ml,40ng/ml)培養(yǎng)細(xì)胞5~7天,結(jié)晶紫染色;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):細(xì)胞單層鋪滿孔板,刮去部分細(xì)胞,加入不同濃度IL-23(0ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)或IP-10(0ng/ml,10ng/ml,

8、40ng/ml)培養(yǎng),觀察劃痕處細(xì)胞生長(zhǎng)情況;細(xì)胞趨化侵襲實(shí)驗(yàn):用Transwell法檢測(cè)不同濃度的IP-10(0ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)處理后肝癌細(xì)胞的趨化能力;采用Transwell檢測(cè)不同濃度IL-23或IP-10(0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)處理后肝癌細(xì)胞的侵襲能力。⑦IL-23或IP-10作用于肝癌細(xì)胞系后HNF4α表達(dá)的檢測(cè):不同比例的Hep

9、G2.215上清加或不加IP-10抗體(0μg/ml,0.5μg/ml,1μg/ml,2μg/ml,4μg/ml)培養(yǎng)肝癌細(xì)胞24h后,HepG2細(xì)胞中HNF4α的表達(dá)采用Western Blot檢測(cè);不同濃度IL-23或IP-10(0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)處理24h后,肝癌細(xì)胞系中HNF4α的表達(dá)采用Western Blot檢測(cè)。⑧IL-23或IP-10作用于肝癌細(xì)胞系后相關(guān)基因及C

10、D133表達(dá)的檢測(cè):不同濃度IL-23或IP-10(0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)處理24h后肝癌細(xì)胞系中相關(guān)基因的表達(dá)采用Realtime PCR檢測(cè);不同濃度IL-23或IP-10(0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)處理24h后肝癌細(xì)胞系中CD133的表達(dá)采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)。⑨不同濃度IL-23或IP-10(0ng/ml,5ng/ml,

11、10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)刺激肝癌細(xì)胞24h后,STAT3蛋白的磷酸化形式p-STAT3、AKT蛋白的磷酸化形式p-AKT、HNF4α、E-cadherin以及GRP78的表達(dá)采用Western Blot檢測(cè)。
  結(jié)果:⑴肝癌細(xì)胞系及組織中細(xì)胞因子及其受體的表達(dá):肝癌細(xì)胞系HepG2中所檢測(cè)的細(xì)胞因子低表達(dá),HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞系HepG2.215中炎性因子TNF、IL-23、HMGB1以及IL-1β表

12、達(dá)增加,以IL-23的表達(dá)增加最為明顯;肝癌細(xì)胞系中均具有IL-23R以及CXCR3的表達(dá);⑵不同肝細(xì)胞系中HNF4α、GRP78以及G6Pase的表達(dá):實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,肝癌細(xì)胞系中均有HNF4α、GRP78以及G6Pase mRNA的表達(dá),并且在HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2.215中其表達(dá)則降低;HepG2.215細(xì)胞中GRP78蛋白的表達(dá)亦降低,HNF4α蛋白的表達(dá)明顯降低;肝癌細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBV24h、48h以及72h時(shí)GRP

13、78和HNF4α的表達(dá):結(jié)果表明瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBV24h、48h以及72h后,GRP78和HNF4αmRNA的表達(dá)變化不明顯,而HBV瞬轉(zhuǎn)72h后,GRP78蛋白水平的表達(dá)降低,HNF4α蛋白水平的表達(dá)顯著降低;⑶IL-23對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響:結(jié)果表明,在一定濃度范圍內(nèi)隨著濃度的升高IL-23促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞S期阻滯、細(xì)胞修復(fù)、細(xì)胞克隆形成以及侵襲轉(zhuǎn)移,減少細(xì)胞凋亡,當(dāng)濃度達(dá)到40ng/ml時(shí),其作用逐漸減弱;⑷IP-10對(duì)肝癌細(xì)

14、胞生物學(xué)行為的影響:在一定濃度范圍內(nèi)隨著濃度的升高IP-10亦能促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞S期阻滯,減少細(xì)胞凋亡;細(xì)胞修復(fù)、細(xì)胞克隆形成、細(xì)胞趨化以及侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng),且具有一定的濃度依賴性;但當(dāng)濃度達(dá)到40ng/ml時(shí),其作用減弱;⑸IL-23對(duì)HNF4α、GRP78、Bcl-2、CD133以及MMP9表達(dá)的影響:在一定的濃度范圍內(nèi),隨著IL-23濃度的升高,HNF4α蛋白表達(dá)降低,GRP78蛋白表達(dá)增加但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;抗凋亡基因Bcl-2

15、、干細(xì)胞化標(biāo)志CD133以及侵襲相關(guān)基因MMP9等mRNA表達(dá)上調(diào);在20ng/ml時(shí)這種作用最為明顯,40ng/ml時(shí)其上調(diào)作用下降;⑹IP-10對(duì)HNF4α、GRP78、Bcl-2、CD133以及MMP9表達(dá)的影響:在一定的濃度范圍內(nèi),隨著IP-10濃度升高,HNF4α的蛋白表達(dá)降低,但對(duì)GRP78的表達(dá)具有促進(jìn)作用,在40ng/ml時(shí)其促進(jìn)作用較為明顯;抗凋亡基因BCL-2、干細(xì)胞標(biāo)志CD133以及侵襲相關(guān)基因MMP9等mRNA表

16、達(dá)上調(diào),在10ng/ml時(shí)這種作用最為明顯,40ng/ml時(shí)其作用降低;⑺不同濃度IL-23和IP-10對(duì)STAT3以及AKT活化的影響不同,IL-23在一定濃度范圍內(nèi),促進(jìn)STAT3活化,隨著濃度升高,對(duì)STAT3活化的促進(jìn)作用減弱,5ng/ml時(shí)促進(jìn)作用最為明顯,而40ng/ml時(shí)對(duì)其活性具有一定的抑制作用;IL-23對(duì)E-cadherin的表達(dá)具有一定的抑制作用,隨著IL-23濃度的升高E-cadherin的表達(dá)降低;IP-10在

17、一定的濃度范圍內(nèi)促進(jìn)AKT活化,10ng/ml時(shí)最為明顯,隨著濃度的進(jìn)一步升高,AKT活化降低;IP-10在一定的濃度范圍內(nèi)對(duì)E-cadherin的表達(dá)具有抑制作用,10ng/ml時(shí)抑制作用最為明顯。
  結(jié)論:①HBV可誘導(dǎo)炎性因子IP-10以及IL-23表達(dá),抑制HNF4α和GRP78的表達(dá),IL-23R以及IP-10的受體(CXCR3)在肝癌細(xì)胞中均有表達(dá),提示IL-23和IP-10分別可與肝癌細(xì)胞系表面相應(yīng)受體結(jié)合從而發(fā)揮

18、不同的生物學(xué)效應(yīng);②證明在一定的濃度范圍內(nèi),隨著濃度的升高,IL-23和IP-10促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞修復(fù)、細(xì)胞克隆形成以及侵襲轉(zhuǎn)移,同時(shí)也能上調(diào)BCL-2、CD133以及MMP9等相關(guān)基因的表達(dá),降低HNF4α的表達(dá),提示IL-23以及IP-10具有促進(jìn)肝癌的作用,其作用可能與HNF4α的表達(dá)降低有關(guān);③IL-23在一定濃度范圍內(nèi),促進(jìn)STAT3活化,具有濃度依賴性,并抑制HNF4α以及E-cadherin的表達(dá);④IP-10在一定的濃

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