肺腫瘤抑制基因GPRC5A在肺癌發(fā)生中的作用.pdf

1、目的：
　　利用Gprc5a基因敲除小鼠的肺癌模型，研究GPRC5A作用的分子機理及關鍵性靶向信號通路，揭示GPRC5A抑制肺癌發(fā)生的作用及生物學意義。
　　材料與方法：
　　1.利用mRNA表達譜芯片分析比較野生型與Gprc5a基因敲除型小鼠氣管上皮細胞(MTEC)的差異表達，用RT-PCR和Westernblot的方法分別在mRNA和蛋白質水平上驗證。
　　2.構建一系列GPRC5A截短體與缺失突變體，運用l

2、uciferase報告基因實驗和Westernblot實驗檢測突變體質粒的功能活性，確定GPRC5A發(fā)揮抑制作用的功能結構域；運用免疫共沉淀和免疫熒光共定位實驗探究GPRC5A抑制EGFR信號通路的作用機制。
　　3.利用EGFR及其他信號通路的特異性抑制劑，分別處理Gprc5a-/-小鼠肺氣管上皮細胞，用CCK-8法檢測不同藥物對細胞增殖的抑制作用。
　　4.利用Gprc5a基因敲除小鼠的肺癌模型，通過RT-PCR、Wes

3、ternblot，檢測Gprc5a-/-小鼠的肺組織中EGFR和STAT3信號通路是否有過度激活的情況。
　　5.在人的肺癌細胞系中，構建GPRC5A的穩(wěn)定表達株，驗證GPRC5A在人肺癌細胞中是否也有抑制EGFR信號通路的作用；裸鼠皮下移植實驗，研究GPRC5A對A549細胞在裸鼠皮下成瘤的影響。
　　結果：
　　1.Affymetrix全基因組表達譜芯片結果表明，Gprc5a基因敲除小鼠MTEC細胞同野生型細胞相比

4、，其EGFR信號通路發(fā)生顯著增高。
　　2.Gprc5a基因敲除小鼠MTEC細胞中p-EGFR和p-STAT3異常性高表達；HEK293T細胞中，GPRC5A的高表達能夠抑制EGF誘導的EGFR-STAT3信號通路的過度激活。
　　3.GPRC5A的跨膜結構域為抑制EGFR信號通路所必須；GPRC5A可與EGFR發(fā)生物理相互作用，該功能由其跨膜結構域所介導，二者在細胞膜上有共定位。
　　4.Gprc5a-/-MTEC細

5、胞對EGFR的3種抑制劑的敏感性都明顯高于Gprc5a+/+MTEC，其他信號通路的抑制劑對這兩種細胞增殖的抑制作用都相差不大。
　　5.Gprc5a-/-小鼠的肺組織中p-EGFR和p-STAT3的表達明顯高于Gprc5a+/+小鼠。
　　6.在人的非小細胞肺癌細胞系H1975和A549中過表達GPRC5A能抑制EGF誘導的或持續(xù)性激活的p-EGFR和p-STAT3；過表達GPRC5A能夠抑制A549細胞在裸鼠皮下的成瘤能

6、力。
　　結論：
　　1.Gprc5a-/-MTEC中，EGFR-STAT3信號通路發(fā)生失控性增強，GPRC5A能夠抑制EGFR-STAT3信號通路的過度激活。
　　2.GPRC5A通過其跨膜結構域對EGFR發(fā)揮抑制作用；GPRC5A能夠與EGFR發(fā)生直接或者間接的相互作用，該功能由其跨膜區(qū)域所介導。
　　3.Gprc5a-/-小鼠MTEC細胞比野生型細胞更加依賴于EGFR信號通路。
　　4. Gprc5a